¡Descarga PCR y más Apuntes en PDF de Microbiología solo en Docsity!
Tema 7: PCR
Amplificación mediante polimerización in vitro de una secuencia especifica de DNA.
Determinar la presencia de una secuencia concreta (gen) dentro de todo el genoma.
Por ejemplo: identificar transgénicos, presencia de secuencias virales, polimorfismos, expresión de genes…
- Reacción de polimerización necesitamos: DNA molde mono hebra, DNA corto sobre el que se unirán nucleótidos (polimerización), Nucleotidos trifosfatos, Polimerasa y sus cofactores.
DNA polimerasa : alarga una cadena de DNA unida a una cadena de DNA molde añadiendo a la cadena que
está creciendo la base complementaria correspondiente.
- (^) Etapas polimerización : · Desnaturalización DNA molde (aprox 94ºC)
· Hibridación (anneling) del DNA iniciador con el Molde (40-60 ºC)
·Síntesis o extensión (a la temperatura optima para la polimerasa)
CICLO : cuando se han dado las tres etapas
REACIÓN EN CADENA (PCR): varios ciclos unidos (25 a 30).
RESULTADO DE UNA REACCIÓN DE PCR DEBE SER ANALIZADO POR OTRAS TÈCNICAS:
detección del fragmento de DNA, que nos permita además determinar su tamaño y su pureza:
Al acabar una PCR s’ha d’utilitzar una altra tècnica per determinar si ha anat be o no. Per exemple una electroforesis d’agarosa o cromatografia d’intercanvi iònic.
Analitzant els resultats d’aquesta PCR es poden comparar diferents PCR’s en diferents condicions com per exemple la temperatura per veure quina es la òptima perquè els primers siguin específics, etc.
Automatització de la técnica: En termocicladors i utilitzant la Taq polimerasa (Thermus aquaticus).
OPTIMIZACIÓN DE UNA REACCIÓN PCR
· Especificitat (màxima) copiar només el nostre fragment de DNA
· Rendiment (màxim) la quant de DNA que obtenim per molècula motlle.
Aquests dos aspectes són contraris, i si millora un, disminueix l’altre.
· Evitar la saturació
· Evitar la contaminació: per exemple, per aerosols de la pipeta.
Variables per optimitzar-la:
· Components de la reacció:
Mg2+ si posem molt magnesi, augmentem la inespecificitat, ja que estabilitza les unions inespecífiques
Primers (Tm): com hi ha dos tipus de primers, s’ha d’intentar que els primers presentin una Tm similar. La Tm depèn de la longitud de la seqüència i de el G-C, llavors s’ha de jugar amb això.
-S’han de tenir en compte les estructures secundaries del primer.
-També la Complementarietat interna, ja que els dos primers queden units i no poden unir-se al teu DNA.
-Si la unió es de 5’ no pasa res greu
-Si la unió es de 3’ OH, la polimerasa podrà replicar aquesta cadena.
-Evitar les sequencies de la mateixa base molt llarga
- S’ha d’intentar que en la part 3’ del primer presenti una mica més de quantitat en C-G’s que en l’altra part del primer. Aixó es donat que les C i G’s són més estables i s’uneixen més fàcilment al teu DNA que les altres dues bases, i assegures que la polimerasa reconeixi aquesta doble cadena formada i sintetitzi DNA.
· Paràmetres del cicle:
-Temp d’anneling
-Temps
-Nº de cicles per lo de la saturació.
S’ha de treballar de 5 a 10 º per sota de la Tm.
Treballar a temps suficients perquè la polimerasa pugui elongar tot el fragment.
PCR APLICACIONS
Real time PCR Podem quantificar PCRs diluïdes segons la seva fase exponencial i així diferenciar dos mostres o més diferents, a la vegada. Pots diferenciar, per exemple, l’expressió a diferents cèl·lules d’un organisme, però com la PCR arriba a un plateau, no es pot diferenciar quina expressa més. Llavors es pot visualitzar els diferents cicles de la PCR i determinar quin conté més DNA. Aquests tipus de PCR ens permet veure a temps real com augmenta cada cicle, i podem obtenir la cinètica d’amplificació. Es pot seguir aquesta PCR a partir de
- Colorant com el bromur d’etidi (SYBR) fluorescent, que s’encaixa dins les bases nitrogenades quan hi ha doble cadena. Inicialment no hi ha dobles cadenes, per tant no hi ha fluorescència, i a mesura que avancen el cicles, hi haurà més dobles cadenes i, per tant, més fluoresceencia. Problema: hi ha hibridacions inespecífiques que també es quantifiquen per aquestes proteïnes.
- Prova hidròlisis: hi ha un fluoròfor i un atenuador. El fluorofor es troba en un primer que hibrida en una zona X del genoma que insertes, no en el primer normal. Quan la polimerasa arriba a aquest primer, el degrada i allibera el fluorofor que cada cop augmentarà. L’atenuador es troba en el mateix primer que el primer fluorofor, i quan es degrada es separen i llavors la fluorescència no quedarà atenuada
- Prova hibridació: Hi ha un primer que presenta al seu 3’ un fluorofor (F1) i un altre primer continu del primer amb un altre fluorofor (F2)a 5’. Entre aquests dos es dona FRET. Si la polimerasa passa per sobre dels primers, desenganxa els dos i els separa, per tant el F2 no emetrà llum. Es mesura la segona fluorescència RFLP La PCR es pot utilitzar per determinar quins al·lels presenta un individu determinat S’amplifica la zona del gen, es talla per enzim R i s’analitza per electroforesi
Detecció de transgènics
