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TEMA 4 : ELECTROFORESIS.
Las electroforesis son típicamente TÉCNICAS ANALÍTICAS para el cálculo de pesos moleculares, ver componentes de una disolución o para determinar la pureza (más utilizado). La técnica consiste en una fuente de energía que generará una tensión eléctrica mediante dos polos, uno positivo y otro negativo y la molécula cargada que irá a un lado o a otro. Definimos como movilidad electroforética a la velocidad de la molécula por intensidad de campo eléctrico.
U =
V
E
La movilidad electroforética de una molécula depende de varios factores: Campo eléctrico : diferencia de potencial entre los polos, intensidad de campo eléctrico… Molécula : La carga, masa y forma. Un factor importante es la densidad de carga, que hace referencia a la relación entre la carga y la masa de una molécula. Tampón : Fuerza iónica, pH, agentes desnaturalizantes. Soporte : Restrictivo o no restrictivo. En una electroforesis libre, el campo eléctrico se aplica a disoluciones o suspensiones por lo que el soporte no ofrece resistencia a las moléculas. Por otro lado, en la electroforesis zonal si ofrece resistencia ya que el campo eléctrico se aplica a un medio o soporte estabilizante haciendo que las moléculas se muevan a diferentes velocidades. Con estos dos tipos de electroforesis podemos observar que existen dos tipos de soporte. No restrictivos: U=f(carga/masa) No tienen resistencia haciendo que todas las moléculas se mueven a la misma velocidad. Lo importante es que existe relación entre el número de carga y masa. Es propio de una electroforesis libre. ELECTROFORESI LLIURE ELECTROFORESI ZONAl Movilidad electroforética puede depender también del soporte
Restrictivos: U=f(carga/masa, forma, tamaño). Propio de las electroforesis zonales. Es importante entender que la variable U, como depende de tantas variables, es mejor tener una U relativa. Se relativiza mediante un frente de iones, es decir, cuántos cm se ha movido una partícula respecto al frente de iones. TIPOS DE ELECTROFORESIS:
1. ELECTROFORESIS ZONAL. Dependen del tipo de soportes: Agarosa (DNA y pocas veces para proteínas). Poliacrilamida (proteínas aunque también para DNA). GELES AGAROSA: En este soporte, el DNA tiene una movilidad electroforética diferencial en función de su tamaño. Las electroforesis de agarosa tienen que ser siempre sumergidas y horizontales. El tampón en el cual se sumerge la agarosa , ayuda de refrigerante ya que la agarosa se derrite con el aumento de temperatura (40Cº). Electroendosmosis : efecto que se produce cuando la agarosa no es pura, haciendo que en vez de actuar de forma neutra, actúa como si estuviera cargada. ELECTROFORESI LLIURE ELECTROFORESI ZONAl ortes: No restrictivos U = f(carga/masa) Restrictivos U = f(carga/masa, forma, tamaño) ad electroforética puede depender también del soporte
Electroforesis zonal
Soporte: usualmente en placa
Fuente de tensión E (campo eléctrico) http://www.rit.edu/~pac8612/electro/Electro_How.html eles de agarosa (almidón) Restrictivos para DNA, no restrictivos para oteínas eles de poliacrilamida (PAGE) Restrictivos para DNA y Proteínas OPORTES:
Movilidad electroforética relativa (Ur
Ur= Rf (molécula problema) / Rf (molécu Rf (distancia recorrida por las moléculas Frente de iones moléculas patrón
intermedios
estión
H y a T naturalitzantes el poro según la concentración ic
Recuperación de DNA de geles de electroforesis. En este caso la técnica ES DE TIPO PREPARATIVA. Por ejemplo, la electroelución se realiza utilizando una membrana de diálisis donde colocas el fragmento de agarosa que posea el DNA (recortas la agarosa después de la electroforesis) además de un campo eléctrico. El DNA se moverá hacia el lado + saliendo del gel y pegándose a la membrana dialítica. Para que se separe de la membrana cambias el sentido del campo eléctrico y quedará disuelto. Otra de las aplicaciones de esta técnica con geles de agarosa es para la separación de topoisómeros. En las moléculas de DNA circular, cuando tienen misma carga, densidad y tamaño, separas el DNA por su forma es decir, si está muy relajado o con forma de supercoil teniendo este último mayor movilidad electroforética. Entre estos dos niveles, podemos encontrar los diferentes topoisómeros dependiendo la forma que tenga. Cuando queremos separar fragmentos de DNA grande (más de 50Kb) también podemos utilizar geles de agarosa, aunque esta vez mediante una electroforesis de campo pulsante. En este caso, el gel es bastante laxo. El DNA queda orientado según el sentido del campo eléctrico. Cuando cambiamos la dirección del campo, el DNA se tiene que volver a reorientar. Jugando con estas velocidades de reorientación nos permite separar fragmentos muy grandes, ya que los que tengan menor tamaño (100Kb) se orientarán más rápido y permite que se vayan moviendo mientras que los que tarden más en orientarse (150Kb) por lo que no se moverán. Como se observa, no existe mucha diferencia de tamaño.
Electroforesis de campo pulsante.
Separación de tamaños muy grandes (misma dificultar en migrar)
Basado en la capacidad de reorientarse (cabeza_cola) (diferente velocidad
de reorientación)
Electroforesis de campo pulsante.
Separación de tamaños muy grandes (misma dificultar en migr
Basado en la capacidad de reorientarse (cabeza_cola) (diferen
de reorientación)
GELES POLIACRILAMIDA (PAGE):
Son típicas de la separación de proteínas, aunque también pueden utilizarse para separar DNA. No obstante, si se utiliza para DNA, estos han de ser fragmentos muy pequeños. La poliacrilamida es un soporte mucho más restrictivo que la agarosa además, como es un polímero artificial, en la poliacrilamida no hay efecto electroendosmótico. No obstante, este compuesto es un agente neurotóxico muy importante (sobre todo en forma de monómero, pues penetra en la piel fácilmente). En los geles se utilizan polímeros de acrilamida con bisacrilamida que, añadiendo también persulfato y TEMED, se genera una reacción en la que se forman cadenas largas de acrilamida, entrecruzadas mediante moléculas de bisacrilamida. Hay factores que afectan a la polimerización, como el pH, la temperatura y la presencia de O2. Las moléculas que podremos separar dependerán de la concentración de acrilamida y bisacrilamida (más concentración, poros más pequeños). Estas polimerizaciones siempre se producen entre dos vidrios, y la electroforesis es vertical. Otra diferencia con respecto a los geles de agarosa, es que estas electroforesis no están sumergidas , tendremos tan solo un tampón arriba y otro abajo, de este modo, todo el campo eléctrico pasa a través del polímero del gel. El tampón de carga es bastante denso (de glicerol), lo cual es importante para que la muestra no quede diluida en el tampón. Todos los tampones de carga llevan consigo un marcador electroforético , que es una molécula pequeña y con color (ej: azul de clorofenil). Este marcador corre siempre por delante de las moléculas y sirve para comprobar si la electroforesis está funcionando bien o no estrictivos para DNA y Proteínas tergents UZAMIENTO: n
Otro método muy similar, consiste en que en vez de tener cuatro reacciones separadas en cuatro tubos, tendrás todo en un único tubo. La diferencia principal es que cada dideóxido tendrás un fluoróforo diferente dependiendo de si es A, C, G o T. Proteínas En el caso de las proteínas se utilizan siempre geles de poliacrilamida. Para detectar las proteínas en el gel se utilizan distintos métodos: -‐ Tinción. -‐ Actividad enzimática. -‐ Marcaje radiactivo de las proteínas. -‐ Por detección inmunológica (Western) Hay diferentes tipos de electroforesis de proteínas:
- (PAGE) Nativo: Las proteínas conservan su estructura (proteínas nativas), su carga intrínseca y su actividad. La proteína se moverá hacia un lado o hacia el otro en el gel dependiendo de su carga intrínseca. Estas electroforesis normalmente se utilizan en muestras más o menos puras de un enzima para detectar isoformas: enzimas muy similares (con la misma estructura y masa), que tan solo varían en algún aminoácido, de modo que tan solo habrá diferencias de movilidad debido a la diferencia en la densidad de carga.
Técnicas Instrumentales Bioquímica Tema 4
- Electroforesis de proteínas en geles de PAGE desnaturalizantes (con urea). La urea se une en la parte hidrofóbica de las proteínas, y rompe su estructura secundaria (rompe enlaces de H, interacciones hidrofóbicas…). Esta capacidad de la urea permite utilizar estos geles para observar la estabilidad estructural de la molécula. Hay proteínas que requieren una acción desnaturalizante muy intensa para romper su estructura (proteínas fibrilares…). Lo que se hace es crear un gradiente creciente de urea en el gel. En estas electroforesis tan solo se carga un tipo de proteína , y se carga en todo el gel y a medida que se va moviendo, va entrando en contacto con la urea. Cuando la concentración de urea es muy baja, la proteína está plegada y puede correr fácilmente pero conforme va aumentando la concentración de urea, la proteína comienza a desplegarse y va viendo reducida su movilidad. Así, en estos tipos de electroforesis las proteínas siempre tienen la misma masa y la misma densidad de carga, por lo que se separarán por la diferencia en su forma.
- Electroforesis de poliacrilamida con detergentes iónicos (PAGE SDS). En este tipo de electroforesis, separamos las proteínas por tamaño. Para esto, tenemos que conseguir que las proteínas tengan la misma densidad de carga y la misma forma. Para conseguir esto se emplea el SDS, un detergente con carácter aniónico en su parte polar. Este detergente tiene la capacidad de interaccionar con las cadenas laterales de los aminoácidos de manera (PAGE) NATIVO proteínas conservan su estructura , su carga intrínseca, su actividad ) U = f(densidad carga, forma, tamaño) Igual forma y tamaño U = f (densidad de carga) ejemplo: comparación de diferentes isoformas de un enzimas (tinción por actividad) Isoformas: una versión de una proteina con pequeñas diferencias de otra isoforma de la misma proteína proteínas con tamaños y formas parecidos pero distinta densidad de carga Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida (PAGE) desnaturalizantes (Urea) UREA desnaturaliza las proteínas Ejemplos: geles para determinar la estabilidad proteica U = f(densidad carga, forma, tamaño) Igual densidad de carga; tamaño U = f (distinta forma)
Si se combina este método de electroforesis con la introducción de agentes reductores , se puede determinar la presencia de puentes disulfuro : el SDS separa todas las interacciones de H, hidrofóbicas, etc. pero no puede romper enlaces covalentes, ni los enlaces peptídicos ni los puentes disulfuro. En cambio, los agentes reductores pueden romper los puentes disulfuro. Se realiza la electroforesis en presencia y en ausencia de los agentes reductores. Si hay puentes disulfuro, se observará diferencia de movilidad en la proteína con respecto a la electroforesis donde no había agentes reductores. Cuando hay agentes reductores, las proteínas con puentes disulfuro se rompen en estos puentes, y corren como proteínas individualizadas.
- Electroenfoque Para separar las proteínas por su punto isoeléctrico , necesitamos que su variable sea la densidad de carga. Para esto, tenemos que trabajar con geles nativos, sin detergentes En estas electroforesis estableceremos un gradiente de pH. De este modo, las proteínas se mueven mientras están cargadas, pero a medida que se mueven van cambiando la carga , hasta que llega a un pH que es igual a su pI, dejando su carga en 0, y por tanto su movilidad será nula. De este modo, podemos focalizar las proteínas en una región del gel donde su pI=0. Estas electroforesis tienen un formato diferente al resto. Normalmente son tiras de poliacrilamida donde se han fijado unas moléculas denominadas inmovilinas , que fijan el pH en las diferentes regiones. Estas electroforesis se fijan sobre una tira de papel: el gel no se Electroforesis de proteínas PAGE-SDS con agentes reductores DTT (ditiotreitol) / b-MERCAPTOETANOL : rompen enlaces covalentes (puentes didulfuro) Determinación de la presencia de puentes desulfuro E
_
+ Ejemp
4 6 8 7 9 5 Proteína 1 pI = 6 Proteína 2 pI = 8 pH < pI + pH > pI _ pH = pI
pHt Gradiente de pH pH 1 pH 2 pH 3 pH 4
encuentra entre 2 placas de cristal, sino sobre un papel. La acrilamida de estos geles tiene que ser nativa, y no puede ser restrictiva , pues las proteínas no se seleccionan por tamaño. Tenemos un soporte horizontal donde depositamos diferentes tiras. En cada tira pondremos una muestra. La tira no está sumergida , sino que hay tampón en los extremos, y el líquido se fija en la tira por capilaridad. Estas electroforesis pueden combinarse con SDS : Después de realizar la electroforesis, se extrae la tira y se coloca un detergente (normalmente SDS). Las proteínas ya están separadas por carga sin detergente, y ahora con detergente cargamos las proteínas en otra electroforesis que las separa por tamaño. De este modo, cada “mancha” en el gel final es una proteína con una carga y una masa molecular determinada. Este tipo de electroforesis bidimensionales se utilizan en proteómica, para detectar la presencia o ausencia de proteínas concretas en diferentes muestras. as o “Tiras de IPG” strechos de pH para una mejor resolución roteínas poco abundantes ento de gradientes “CyberGels” es tamaños es de pH lineales o no lineales
enerar el gradiente de pH:
ados: anfolitos portadores **PRIMERA DIMENSIÓN 2 3 1
- Aplicar la muestra en la tira IPG.
- Aplicar un campo eléctrico.
- Las proteínas se moveran hasta alcanzar el pH que corresponde a su pIs (su carga neta es cero) quedarán enfocadas a lo largo del gradiente de pH. Electroforesis bidimensional: Electroenfoque-PAGE-SDS**
