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Asignatura: Actuació en situació d'emergència extrahospitalària, Profesor: , Carrera: Infermeria (Gimbernat), Universidad: UAB
Tipo: Guías, Proyectos, Investigaciones
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Background: Recently, a simple and rapid commercial assay (BD MGIT TBc ID) has been developed using a monoclonal antibody anti-MPT64 for the differentiation of Mycobacterium tuberculosis complex from other mycobacteria by immunochromatography. Methods: We evaluate in this work the clinical usefulness of the test for the identification of 51 strains of M. tuberculosis complex and 24 strains of other mycobacteria belonging to 14 different species, compared with the method of hybridization with DNA probes. Results: Immunochromatographic method performance was excellent, with sensitivity, specificity, positive and negative predictive values of 98, 100, 96.1, and 98.7%, respectively. Conclusions: These results indicate that immunochromatographic assay can be safely used for rapid identification of M. tuberculosis complex in combination with culture in liquid media. The test is extremely simple, provides results in just 15 minutes, requires no complex equipment or specialized personnel and may be a good alternative to molecular methods, especially in small laboratories. Key words:Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, mycobacte- ria, tuberculosis, immunochromatography
La utilización de medios de cultivo líquidos para el diagnóstico de tuberculosis ha reducido el tiempo de detección de Mycobacterium tuberculosis^1. Sin embargo, desde el punto de vista clínico, es muy importante la diferenciación del complejo M. tuberculosis de otras micobacterias con el fin de aplicar cuanto antes un tratamiento adecuado y prevenir la diseminación de la enfermedad 2. La identificación de micobacterias es compleja, pero la aparición de los métodos de
Introducción: Recientemente, se ha desarrollado un sencillo y rápido método comercial (BD MGIT TBc ID) que emplea un anticuerpo monoclonal anti-MPT64 para la diferenciación del complejo Mycobacterium tuberculosis de otras micobacterias por inmunocromatografía.
Métodos : Evaluamos en este trabajo la utilidad clínica del método para la identificación de 51 cepas del complejo M. tuberculosis y 24 cepas de otras micobacterias pertenecientes a 14 especies diferentes, comparándolo con el método de hibridación con sondas de ADN.
Resultados: El resultado del método inmunocromatográfico fue excelente, con una sensibilidad, especificidad y valores predicitivos positivo y negativo de 98, 100, 96,1 y 98,7%, respectivamente.
Conclusiones: Estos resultados indican que el método inmunocromatográfico puede ser usado con seguridad para la identificación rápida del complejo M. tuberculosis en combinación con el cultivo en medios líquidos. El método es extremadamente sencillo, ofrece resultados en sólo 15 minutos, no requiere equipamiento complejo ni personal especializado y puede ser una buena alternativa a los métodos moleculares, especialmente en pequeños laboratorios.
Palabras clave:Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, mico- bacterias, tuberculosis, inmunocromatografía,
Servicio de Microbiología. Hospital Universitario Puerta del Mar. Cádiz.
Pedro García-Martos, Lidia García-Agudo, María José Rodríguez- Jiménez, Manuel Rodríguez-Iglesias.
Correspondencia: Dr. Pedro García-Martos Av. Ana de Viya 13, 2-B. 11009 Cádiz Tfno: 956- Fax: 956003081 E-mail:[email protected]
inmunocromatográfico
biología molecular ha posibilitado ampliamente la caracterización de especies y el reconocimiento de nuevos taxones micobacterianos 3,4^. El inconveniente que presentan muchos de estos métodos es su complejidad, aparte del precio elevado y la dificultad para introducirlos en modestos laboratorios. Actualmente, la hibridación con sondas de ácidos nucleicos constituye uno de los métodos más empleado en la identificación de las especies de interés clínico, pero se hace necesario disponer de un método rápido y sencillo.
En los últimos años ha aparecido en el mercado un método inmunocromatográfico que detecta el antígeno MPT64, también denominado MPB64, una fracción proteica micobacteriana de 24 kDa segregada específicamente por el complejo M. tuberculosis durante el crecimiento en el cultivo 5,6^ y que constituye un excelente marcador para su identificación2,7-11. Este antígeno se une en una tira de nitrocelulosa a anticuerpos monoclonales específicos, conjugados con partículas de oro coloidal marcadas, producidos por hibridomas obtenidos de la fusión de células de mieloma P3U1 con células esplénicas de ratón inmunizado con MPT64.
El objetivo de nuestro estudio ha sido evaluar la utilidad del método comercial BD MGIT TBc ID, un inmunoanálisis cromatográfico rápido para la detección cualitativa del complejo M. tuberculosis en cultivos líquidos, en comparación con el método de hibridación con sondas de ADN.
Estudiamos 75 cepas de micobacterias cultivadas en el medio BBL MGIT™ Mycobacterial Growth Indicador Tube® (Becton Dickinson, USA), entre las que se incluyeron 15 especies diferentes: 50 del complejo Mycobacterium tuberculosis , 1 M. bovis BCG, 4 M. avium , 2 M. intracellulare , 2 M. kansasii , 1 M. marinum , 3 M. fortuitum, 3 M. chelonae , 2 M. abscessus , 1 M. alvei , 1 M. brumae , 1 M. smegmatis , 1 M. peregrinum , 1 M. mageritense , 1 M. senegalense y 1 M. neoaurum. La identificación del complejo M. tuberculosis se realizó por hibridación con sondas de ADN Accuprobe® (Gen- Probe, bioMérieux, Francia); la identificación del resto de micobacterias se llevó a cabo por métodos moleculares.
Todas las cepas se procesaron mediante el método BD MGIT™ TBc ID® (Becton Dickinson, USA) antes de 72 horas de la positividad del cultivo, siguiendo las recomendaciones del fabricante. Un volumen de 100 μl del cultivo fue depositado en el pocillo de muestra de la tira de análisis correspondiente y, transcurridos 15 minutos, se registró el resultado. La observación de dos bandas de precipitación de color rosa-rojo, una en la posición “C” (control) y otra en la posición “T” (análisis), fue considerada indicativa de la presencia de antígeno MPT64 en la muestra; la ausencia de banda en la posición “T” fue interpretada como un resultado negativo; la ausencia de banda en la posición “C” invalidó el resultado.
Con los datos obtenidos, calculamos la sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo del método inmunocromatográfico para la
identificación del complejo M. tuberculosis con respecto al método de hibridación con sondas de ADN. Por otra parte, evaluamos el rendimiento del método inmunocromatográfico en las cepas del complejo M. tuberculosis cultivadas en medio sólido de Löwenstein-Jensen. Para ello tomamos 1-3 colonias del cultivo y las depositamos en un tubo con 8-10 perlas de vidrio, las disgregamos en un rotador-mezclador (Vórtex) hasta observar turbidez homogénea en las paredes del tubo y resuspendimos en 1 ml de tampón fosfato pH 7,4 con 0,1% de Tween 80, procediendo posteriormente a la realización del método inmunocromatográfico de la misma forma que para el medio líquido. Empleamos también como diluyente 1 ml de medio Middlebrook 7H9 en 10 de estas cepas y, en otras 10, 1 ml de solución salina.
Los resultados obtenidos en la evaluación del método inmunocromatográfico BD MGIT TBc ID sobre las 75 cepas estudiadas se muestran en la tabla 1. Un total de 50 cepas pertenecientes al complejo M. tuberculosis dieron positiva la prueba, pero la cepa de M. bovis BCG dio resultado negativo. El resto de las cepas de micobacterias fueron negativas. La coloración de las bandas de reacción fue perceptible, generalmente, antes de los 10 minutos, pero la intensidad máxima del color apareció a los 15 minutos. Siete cepas con una lectura entre 50.000-90.000 RUL en el método de
Especies M. tuberculosis M. bovis BCG M. avium M. intracellulare M. kansasii M. marinum M. fortuitum M. chelonae M. abscessus M. alvei M. brumae M. smegmatis M. peregrinum M. mageritense M. senegalense M. neoaurum
Número de cepas 50 1 4 2 2 1 3 3 2 1 1 1 1 1 1 1
Positivas 50 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Negativas 0 1 4 2 2 1 3 3 2 1 1 1 1 1 1 1
Tabla 1 Resultados de diferentes especies de micobacterias analizadas mediante el método BD MGIT TBc ID.
inmunocromatográfico