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TÉCNICAS INSTRUMENTALES BÁSICAS
GRADO EN BIOTECNOLOGÍA
Práctica Electroforesis: Separación de aminoácidos en papel
Competencias específicas: Realizar electroforesis con biomoléculas
Lugar de realización: Laboratorio A1, Depart. Bioquímica y Biol. Molecular A. Facultad de Veterinaria
Profesor: Dr. Fernando Gandía Herrero
Consideraciones generales:
- Los alumnos deberán acudir al laboratorio provistos de: bata, boletín de la práctica, lápiz y regla.
PRECAUCIONES
- Se deben extremar las precauciones al trabajar con una fuente de corriente continua.
- En todo momento deberán seguirse las recomendaciones del manual de “Seguridad en el Laboratorio” de la Universidad de Murcia, disponible en la zona de Recursos del Aula Virtual.
1. INTRODUCCIÓN
Las técnicas electroforéticas se basan en la separación de moléculas cargadas por efecto de su migración en un campo eléctrico. La separación depende de la densidad de carga (relación carga/masa). El uso de soportes sólidos proporciona apoyo y disminuyen el efecto de las corrientes de convección, difunden mejor el calor y ayudan a disiparlo y disminuyen la difusión de las moléculas una vez acabada la electroforesis.
El soporte utilizado para llevar a cabo la electroforesis puede ser variado y su elección depende de la naturaleza de las sustancias a separar. Papel, acetato de celulosa y geles de agar y acrilamida son los que se utilizan generalmente.
Movilidad electroforética (velocidad por unidad de campo):
El punto isoeléctrico (pI) es el valor de pH para el cual las cargas positivas y negativas presentes en una biomolécula se compensan dando lugar a una carga neta nula ( z = 0) para la especie considerada. La carga es mayor cuanto más alejado se está del valor de punto isoeléctrico. La velocidad de migración de una biomolécula es función de su carga neta, y por tanto depende del valor de pH del tampón utilizado en el experimento.
La electroforesis en papel se utiliza principalmente para biomoléculas pequeñas como por ejemplo aminoácidos. Puesto que para los aminoácidos se puede considerar que todos ellos poseen una masa parecida (moléculas pequeñas) la separación depende exclusivamente de la carga. Si se aplica a una disolución conteniendo aminoácidos (normalmente sobre un soporte) un par de electrodos conectados a una fuente de corriente continua, los aminoácidos se moverán hacia un electrodo u otro, según estén cargados positiva o negativamente. Si el pH del medio coincide con el pI del aminoácido éste no se moverá.
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3.2. Realización de la electroforesis.
- Rociar el papel con la disolución reguladora de pH.
- Poner disolución reguladora también en ambos electrodos del aparato de electroforesis.
- Montar el sistema de electroforesis y colocar el papel con los extremos sumergidos en los dos electrodos.
- Cerrar y conectar la corriente continua.
- Dejar que la electroforesis corra durante 30-40 min.
3.3. Revelado.
- Desconectar el sistema de electroforesis.
- Sacar el papel con pinzas, evitando tocarlo con los dedos.
- Secar el papel con el secador o en la estufa.
- Una vez seco, rociar el papel con la disolución de ninhidrina (evitar contacto con la piel). Hacerlo en la campana extractora.
- Llevar el papel a la estufa y secar durante al menos dos minutos
Esquema de la reacción de ninhidrina con aminoácidos
3.4. Análisis.
- Examinar las manchas reveladas y sacar conclusiones de acuerdo con las siguientes cuestiones.
4. RESULTADOS
- Comparar la posición de las manchas, dibujar un esquema e identificar los aminoácidos revelados.
- Al examinar las manchas se observa que una de ellas prácticamente no se ha movido de la línea de origen a pH 6.1. ¿A qué aminoácido corresponde? ¿Por qué no se ha movido?
- Representar las fórmulas iónicas de los aminoácidos que se han movido.
- Al realizar la electroforesis con un tampón de pH 3.0, ¿qué ha sucedido con la migración electroforética? ¿Qué hubiera pasado a pH 8.5?
- ¿Serviría la electroforesis para separar entre sí diversos hidratos de carbono tales como glucosa, manosa, y galactosa?
