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EL MICROSCOPIO OPTICO. FUNDAMENTOS Y MANEJO
Introducción
El microscopio es un instrumento óptico que amplifica la imagen de un objeto pequeño. Es por tanto el instrumento utilizado en un laboratorio para observar y estudiar células y microorganismos. Desde su invención, el microscopio ha sido una gran herramienta en los estudios biológicos. En esencia, un microscopio óptico está formado por un tubo provisto de dos lentes (una en cada extremo) que amplían la imagen del objeto, que está además intensamente iluminado. El sistema es parecido a un telescopio. De las dos lentes, una es la lente amplificadora y la otra es la lente secundaria. La primera, es la lente que se encuentra próxima al objeto a estudiar y se denomina lente objetivo. La otra lente se sitúa junto al ojo del observador, para que se forme la imagen aumentada en su retina y se denomina lente ocular. Ambas lentes están montadas en los extremos opuestos de un tubo cerrado, de forma que el primero se encuentra en el punto focal del segundo. De esta forma, la luz que pasa por un objeto es focalizada por ambos sistemas de lentes, por lo que cuando se mira a través del ocular se ve una imagen “virtual” aumentada de la imagen real. Si se sustituye el ojo del observador por una cámara fotográfica, se pueden obtener fotografías de la preparación histológica a los mismos aumentos a los que se observa. Un dispositivo denominado condensador concentra la luz emitida por la fuente luminosa sobre el objeto.
El MICROSCOPIO ÓPTICO , el de uso más común en laboratorio, se sirve de la luz visible para crear una imagen aumentada del objeto. La capacidad amplificadora del microscopio depende de la longitud focal de los dos sistemas de lentes que lo forman. La longitud o distancia focal (la distancia que hay desde la línea media de la lente al punto en el que convergen en un foco los rayos paralelos que atraviesan la lente), es función del grado de curvatura de la lente.
Pero en un microscopio importa no sólo los aumentos que puede ofrecer la lente, sino también y de manera especial el PODER DE RESOLUCIÓN. Este se define como “la capacidad de distinguir como imágenes distintas dos puntos cercanos”. El poder de resolución es la inversa del LÍMITE DE RESOLUCIÓN y éste se define como “ la distancia mínima entre dos puntos para que puedan distinguirse como tales ”. Este límite de resolución depende de tres variables, que vienen recogidas en la ecuación de Abbé.
r = 0.61 λ
n sen α
La resolución r , depende de: λ es la longitud de onda de la luz empleada como iluminación, n es el índice de refracción del medio que hay entre la muestra y la lente objetivo, y α es la apertura angular de la lente. 0.61 es cte. De las tres variables, la que más se puede modificar y que más afecta al valor del límite de resolución es la longitud de onda de la luz empleada, que en la luz blanca es de media 550 nm (nanómetros).
En el mejor de los casos, el límite de resolución de un microscopio óptico es de 240 nm. Para el ojo humano, el límite de resolución es de 0.23 mm (equivalente a 230 micras ó bien 230.000 nm); esto significa que el microscopio óptico permite aumentar casi 1000 veces el poder de resolución del ojo.
En cambio, los electrones, con una longitud de onda mucho menor que la luz (0.005 nm, 100.000 veces menor), pueden mostrar estructuras muchísimo más pequeñas. Así, el límite de resolución en el microscopio electrónico puede llegar fácilmente a 2 nm (100 veces mejor que el óptico, 100.000 veces mejor que el ojo humano). Hay dos tipos básicos de microscopios electrónicos: el de transmisión y el de barrido. El de transmisión dirige el haz de electrones hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada del objeto. Deben utilizar muestras cortadas en capas finísimas. Un microscopio electrónico de transmisión puede aumentar un objeto hasta un millón de veces. El de barrido crea una imagen ampliada de la superficie de un objeto. Aquí no es necesario cortar el objeto en capas finas, pues el microscopio va escaneando con electrones la superficie del objeto. Un microscopio electrónico de barrido puede ampliar los objetos 100.000 veces. Es muy útil, porque al contrario que el de transmisión o los microscopios ópticos (excepto lupas), el de barrido produce imágenes tridimensionales realistas de la superficie del objeto.
EL MICROSCOPIO OPTICO Existen dos grupos de microscopios ópticos, los simples y los complejos, que se diferencian en su capacidad amplificadora y en la complejidad del sistema de lentes que utilizan. Microscopio óptico simple : el más sencillo es la lente convexa doble, con una distancia focal corta. Estas lentes permiten aumentar un objeto hasta 15 veces. También se les llama microscopios de bajo poder. Hay al menos dos tipos de microscopios de bajo poder amplificador: los monoculares y los binoculares. Los monoculares tienen muy bajo poder amplificador y se utiliza esencialmente para niños. Los microscopios binoculares de bajo poder, llamados también estéreo microscopios o lupas binoculares, en cambio, ofrecen mayor aumento. Estos se caracterizan porque presentan dos objetivos, de forma que el objeto se puede ver en forma estereoscópica o tridimensional.
Microscopio óptico complejo : son binoculares y se caracterizan porque disponen de varios juegos de lentes, con las que se consigue aumento mucho mayores, pudiendo llegar incluso a aumentar un objeto hasta 2000 veces. Estos microscopios son los más utilizados en un laboratorio general de investigación. En este caso, el objetivo está compuesto por varias lentes que crean una imagen real aumentada del objeto examinado. El aumento de la imagen, dependerá de las longitudes focales de los dos sistemas de lentes en juego.
Objetivo de la práctica Esta práctica tiene como misión tres puntos clave:
- conocer e identificar los distintos componentes de un microscopio óptico complejo,
- comprender la función de cada parte del microscopio y
- aprender a manejarlo correctamente para poder estudiar las diferentes muestras biológicas que se llevarán a cabo en diferentes sesiones de prácticas.
Fig. Componentes principales de un microscopio óptico típico
- La platina: situada bajo el revólver, es una pieza horizontal sobre la que se coloca la muestra o preparación. Está perforada en el centro para dejar paso a los rayos luminosos procedentes de la fuente de luz. Bajo la platina, hay una pieza del sistema óptico, el diafragma. La platina lleva unas pinzas, que permiten sujetar a la platina el portaobjetos donde va la muestra a observar. Y también lleva el llamado foco coaxial: dos ejes de desplazamiento horizontal, perpendiculares entre sí, que permiten ajustar la muestra para ser observada. Un eje mueve la muestra en sentido lateral (izquierda-derecha del observador) y el otro eje en sentido frontal (alejando-acercando la muestra al observador). Los dos movimientos se realizan en el plano de la platina
- El tubo: pieza cilíndrica y hueca en cuya parte superior se halla una lente (el ocular) y en la inferior la pieza giratoria llamada revólver, donde van enroscadas las otras lentes (los objetivos).
- Tornillos de enfoque: permiten el desplazamiento del tubo (o bien de la platina) mediante una cremallera dentada, de forma que al acercar o alejar el tubo (o la platina) se consigue el enfoque correcto de la muestra. Se trata del tornillo macrométrico (que realiza un desplazamiento rápido) y el tornillo micrométrico (que realiza un desplazamiento fino y preciso)
- la parte o SISTEMA ÓPTICO : comprende los sistemas de lentes y el aparato de iluminación. Consta de estas piezas:
- Ocular: llamado así porque es la lente que se sitúa cerca del ojo del observador. Tiene como misión aumentar la imagen que produce el objetivo. Su aumento, viene señalado por una cifra (5x, 10x, 20x, etc). Se puede desmontar e intercambiar por otros con distintos aumentos o funciones (agujas para señalar, retículos, etc.).
Algunos microscopios llevan en la parte donde se coloca el ocular un sistema regulador de la distancia focal, que permite ajustar la distancia focal de los oculares con la distancia focal del observador.
- Objetivo: es la lente que se sitúa sobre la preparación o muestra a observar. Amplía la imagen de ésta. Es el elemento óptico más importante, ya que es el que produce la imagen aumentada del objeto. La imagen que forma la observamos invertida (el objetivo funciona como una cámara fotográfica), de ahí que lo que observamos a la derecha y arriba de la preparación se encuentre en realidad a la izquierda y abajo, y viceversa. Los aumentos de los objetivos vienen indicados sobre los mismos y son en general: 4x, 10x y 40x. En el revolver suele haber un cuarto objetivo, llamado objetivo de inmersión , que aumenta 100x. Este objetivo se utiliza colocando previamente sobre el cubreobjetos de la preparación una gota de un aceite especial. Este aceite de inmersión mejora la resolución de la imagen, gracias a las propiedades de refracción de la luz que posee. El objetivo de inmersión debe acercarse a la muestra con mucho cuidado, de modo que toque la gota de aceite pero no llegue a golpear bruscamente la preparación, que se rompería fácilmente, e incluso en algún caso a romperse el propio objetivo, algo muy grave. El aumento total que ofrece el microscopio se obtiene multiplicando los aumentos del ocular por los del objetivo con el que se está realizando la observación.
- Diafragma o iris: es una pieza situada bajo la platina o sobre la fuente de luz, que abriéndolo o cerrándolo regula la cantidad de luz que llega al objetivo. El diafragma permite controlar la intensidad de luz y el tamaño del cono de luz proyectado sobre la muestra.
- Condensador: lente o conjunto de lentes que focalizan la luz sobre la muestra. El uso de condensador permite mejorar la observación de la muestra. Cuando está presente en el microscopio, el condensador se sitúa generalmente bajo la platina y por encima del diafragma.
