practica microscopio, Ejercicios de Biología

¡Descarga practica microscopio y más Ejercicios en PDF de Biología solo en Docsity!

1. Recuento de microalgas al microscopio. Aunque en la actualidad la mejora de la sensibilidad de los métodos automatizados de recuento (Coulter Counter) y la citometría de flujo están aportando nuevas formas de estima del número de células microalgales tanto en poblaciones naturales como en cultivo, el recuento al microscopio utilizando hematocitómetros sigue siendo el más utilizado para los análisis rutinarios. La cámara de recuento Improved Neubauer es la más utilizada en hematología y también se utiliza para la realización de recuentos celulares al microscopio de microalgas marinas, aunque existen otras cámaras de recuento como la Sedwick-Rafter, que permite el recuento directo de 1 mi de muestra y se utiliza para muestras ambientales poco concentradas, Las cámaras comerciales Improyed Neubauer actuales constan de dos áreas de recuento separadas por surcos. En cada área aparece una retícula de recuento con la estructura de la Figura 2. Cada retícula consta de cuatro áreas cuadriculadas L de 1 mm? de superficie que son las utilizadas para el recuento de leucocitos. Estas cuadrículas son las que se utilizan para contar la mayor parte de las células microalgales. En el centro de la retícula aparecen áreas cuadriculadas divididas en cuadros más pequeños, que son las equivalentes a una cámara de recuento Thoma. Cuando se realizan recuentos de células de microalgas de un diámetro menor de 5 ¡um (por ejemplo, para el recuento de Nannochloropsis sp. que es ampliamente utilizada en alimentación de rotíferos para el cultivo de larvas de peces) se pueden utilizar también las áreas £ de la zona central, que tienen una superficie de 0.04 mn”, y son las utilizadas en hematología para el recuento de eritrocitos. El cubreobjetos utilizado para las cámaras de recuento es de mayor grosor de los normales para evitar que se combe al cargar la muestra, lo que introduciría un error volumétrico. Cuando el cubreobjetos está correctamente colocado en la cámara la distancia entre la superficie de la cámara y el cubreobjetos es de 0.1 mm. Por lo tanto, cuando la cámara esta correctamente montada y cargada, el volumen correspondiente a una zona L es de 0.1 ul y el de una zona E es de 0.004 ul. L Figura 1. Estructura de la ratícula de recuento de la cámara Improved Neubauer, Las microalgas se suelen contar en los campos L, que equivalen a 10% mL de volumen 10) ore E como SL CARAERS ANDER LOADED Figura 2. Ejemplo de cámara de recuento correctamente cargada (A) y cargada defectuosa (B). 1. Preparación de la muestra. Cuando se realizan recuentos de cultivos concentrados de microalgas es necesaria la dilución previa de la muestra para realizar el recuento. Para que el recuento sea estadísticamente fiable debemos contar entre 30 y 300 células en una zona L, es decir, en 0,1 al, por lo tanto la concentración en la muestra que cargamos debe estar entre 300.000 y 3,000,000 de células por mililitro. Se realizará la dilución adecuada con agua de mar para obtener esta concentración dependiendo de la concentración que estimemos en nuestra muestra original, Si las células son móviles se añadirá una gota de lugol a la dilución. 2, Montaje y carga de la cámara 1. La Limpiar la cámara con alcohol o lejía diluida para evitar que queden restos de grasa por su manipulación que afectarían al volumen cargado y a la correcta adherencia del cubreobjetos. Enjuagar con agua destilada y secar completamente. Colocar el cubreobjetos: Humedecer las guias laterales donde se apoyará el cubreobjetos y colocarlo presionando ligeramente y moviéndolo hasta que quede perfectamente adherido, Debe comprobarse la formación de los anillos de Newton (líneas irisadas) que indican que el cubreobjetos está bien colocado y por lo tanto el volumen que vamos a cargar es el estimado. Cargar la cámara sobre una superficie plana por eapilaridad utilizando una pipeta Pasteur. La pipeta debe acercarse al borde del cubreobjetos dejando que se cargue por capilaridad. La carga debe realizarse de una sola vez y no deben formarse burbujas ni desbordar hacia los surcos que limitan cada una de las dos árcas (Figura 2). Si eso ocurre la cámara debe desmontarso, limpiarse y se vuelve a cargar. Si se trabaja con especies de pequeño tamaño, por ejemplo Nanrochloropsis, es necesario dejar sedimentar las células durante 5-10 minutos antes de empezar el tecuento. Para evitar la evaporación la cámara se debe mantener en una