practicas de laboratorio, Apuntes de Biología

¡Descarga practicas de laboratorio y más Apuntes en PDF de Biología solo en Docsity!

TÉCNIQUES CIENTÍFIQUES INTEGRADES II

Adaptació del guió amb ISBN 978-84-8458-378-

CAS 2

BUSCANT EL CULPABLE

CAS 2. Presentació del CAS 4

Maties Fontferrer ha estat acusat d’assassinar Marina Canver. En aquests moments s’està celebrant el judici tot i que ja fa temps que els fets van tenir lloc. L’advocat defensor ha demanat contrastar les proves presentades per la fiscalia. Amb aquesta finalitat, es contracten els serveis dels laboratoris UNIGI LABORATORIS per tornar a analitzar les proves més rellevants del cas. Aquesta empresa és precisament on treballeu com a experts en mètodes d’anàlisi. L’encàrrec es basa en tornar a repetir L’anàlisi de diferents mostres trobades a l’escenari del crim , elaborar l’informe i presentar les conclusions que cregueu oportunes sobre el cas.

Com a informació addicional, us han presentat l’escrit següent sobre la descripció dels fets i les proves/mostres de què disposen:

La víctima la van trobar tombada al terra del menjador. No presentava cap ferida, però tenia un fort cop al cap probablement de la caiguda. A les mans tenia unes tisores impregnades del que semblava sang. Duia les ungles mig pintades de vermell. Al seu costat, una petita bassa d’un líquid transparent amb una marca de petjada. La taula estava parada i a la cuina els focs estaven encesos. De la taula, un got pràcticament buit amb el que semblava aigua era el més sospitós. Just al cantó hi havia un potet petit destapat que contenia una pols blanca.

El vidre de la finestra del menjador estava mig trencat i hi havia un tall de roba que s’havia quedat enganchada. A terra, entre els vidres, unes ulleres trepitjades.

El cadàver va ser descobert pel marit de la senyora Marina, que en entrar al garatge per aparcar el cotxe va sentir un soroll fort semblant al de vidres trencats.

Revisant què se’n sabia dels implicats, la policia havia informat que la senyora Marina Canver era propietària d’una empresa de transports. Patia taquicàrdies i era hipertensa, per la qual cosa prenia medicaments i no podia prendre estimulants.

En Maties tenia bona salut, únicament tenia problemes de miopia. Condemnat nombroses vegades per baralles i disturbis, ara és el sospitós principal de la mort de la Marina.

A casa de la senyora Canver hi treballava Lis Sailor des de feia més de 10 anys. Aquesta s’encarregava de les feines de la llar i cuinava. Les males llengües dels veïns deien que la Lis i en Maties tenien alguna relació sentimental amagada. La Lis era hipermetrop i va ser ingressada en un hospital una hora després dels fets. Va declarar que l’havien atracat al mig del carrer quan tornava a casa.

Les mostres per analitzar al laboratori són les següents:

Mostra 1 i 2: restes impregnades a les tisores Mostra 3: líquid transparent formant una petita bassa al terra Mostra 4: líquid del got (transparent) Mostra 5: vidre de les ulleres

0. PRESENTACIÓ DEL CAS

CAS 2. Organització 5

Les activitats avaluables programades en el CAS 2 es presenten a continuació:

Activitats relacionades amb l’expressió oral:

Les notes de les presentacions orals representen el 10% de la nota global de l’assignatura Tècniques científiques integrades 2. El primer dia del CAS 2 s’organitzarà una taula rodona en relació a la temàtica següent:

• Dotació cromosòmica de l’espècie humana i tipus d’anomalies: Realització d’un cariotip humà. Tècniques de tinció i bandes G. Aplicacions de la determinació del cariotip i anomalies humanes.

En aquesta activitat s’avaluarà els estudiants que presenten el treball. Així mateix es valorarà la intervenció de la resta d’estudiants que facin preguntes i comentaris. Per saber com s’organitza aquesta activitat aneu (veure fitxe Moodle “Descripció activitat taula rodona”).

Per valorar la presentació es tindrà en compte, a més del contingut, aspectes com l’estructura, la presentació, la claredat, l’entonació i el llenguatge formal i amb el vocabulari científic propi de la temàtica.

Proves escrites (prelab):

Cada dia de pràctiques de laboratori (2on, 3er i 4art dia), abans de la sessió pràctica, es farà una prova escrita en relació als conceptes, tècniques, procediments, càlculs, etc. que es treballaran en aquella sessió. La mitjana de les pre-labs d’aquest CAS 2 es penjarà al Moodle

Seguiment de les habilitats adquirides al laboratori i recollida de dades

La nota d’aquesta activitat té en compte el seguiment diari del professor a la sessió de pràctiques i el document “Recull de dades” lliurat.

En cas de presentar el “Recull de dades”, en el guió de les pràctiques, al final de cada pràctica, trobareu l’apartat “Recull de dades Ompliu el word de cada pràctica, recopilar en un mateix fitxer els recull de dades del CAS 2 i passar a pdf. Aquest serà el document a lliurar al Moodle. No s’acceptarà cap informe lliurat fora de termini. La capacitat màxima del document és d’5 Mb.

Nomenclatura del fitxer: ( número grup) CognomNom_RecCAS2.pdf Exemple: 02MartiJordi_RecCas2.pdf

IMPORTANT: no es pot enviar el “Recull de dades” fet a mà i escanejat!!

La data límit per lliurar el Recull de dades: Grups 15, 16, 17, 1, 2 i 3: divendres 17 d’octubre Grups 18, 19, 20, 4, 5, 6: divendres 24 octubre Grups 21, 22, 23, 7, 8 i 9: divendres 14 novembre Grups 10, 11 i 12: divendres 21 novembre Grups 13 i 14: divendres 28 de novembre

1. ACTIVITATS AVALUABLES EN EL CAS 2

CAS 2. Organització 7

Primer dia:

• Taula rodona on els experts són els alumnes que hagin preparat el tema següent:

Dotació cromosòmica de l’espècie humana i tipus d’anomalies: Realització d’un cariotip humà. Tècniques de tinció i bandes G. Aplicacions de la determinació del cariotip i anomalies humanes.

L’activitat es basa en una taula rodona amb els alumnes que han preparat el tema proposat per a aquest cas. El professor farà de moderador i anirà donant la paraula als diferents participants de la taula rodona perquè vagin tractant els diferents punts sobre la temàtica. Així, no es tracta que l’alumne expliqui tot el treball, sinó que es vagi discutint per parts. S’ha de saber explicar i defensar, sense necessitat d’apunts, cadascun dels punts proposats en la temàtica.

L’audiència la formaran els alumnes que no han preparat el tema. Hi participaran a partir de preguntes i/o dubtes als membres de la taula rodona. Caldrà que es presentin sempre amb el seu nom abans de qualsevol intervenció. El professor tindrà únicament el paper de moderador i no actuarà en cap cas com a expert en el tema.

Durant l’activitat, el professor avaluarà les presentacions dels membres de la taula rodona i valorarà positivament els alumnes que hi intervenen amb preguntes, comentaris, etc.

• Un cop finalitzat el debat, a la mateixa aula, es processarà la primera mostra basada en l’anàlisi cromosòmica de la mostra de sang.

2on, 3er i 4rt dia:

Les sessions pràctiques d’aquests dies es duran a terme en diferents laboratoris per processar les mostres del cas que ens ocupa. Prèviament a cada sessió pràctica, es farà una prova escrita (prelab) en relació a la pràctica. Durant les pràctiques, el professor comprovarà l’assistència de tots els estudiants i valorarà les habilitats i destreses que va adquirint l’estudiant i la recollida de la informació i tractament de les dades.

És important anotar-ho tot a la llibreta i recollir els resultats omplint l’apartat de RECULL I TRACTAMENT DE DADES que hi ha en el guió per a cada pràctica. Aquest apartat vol ser un guió per anar aprenent a recollir i organitzar les dades. És important contestar les qüestions a mesura que es van plantejant. Aquestes preguntes volen ser una reflexió sobre les tècniques i les bases científiques per comprendre millor els procediments experimentals.

2. ORGANITZACIÓ DE LES PRÀCTIQUES

CAS 2

CAS 2. Informe pericial 10

4. RESULTATS I DISCUSSIÓ

En aquest apartat es presenten els resultats de cada mostra. També cal incloure- hi la comparació amb les mostres de referència o les dades bibliogràfiques que permeten arribar al resultat final, els càlculs, etc. S’inclourà també en aquest apartat les rectes de calibratge si s’han utilitzat.

Màxim una pàgina sense tenir en compte taules, gràfics, fotos

5. CONCLUSIONS I PROPOSTES

En aquest apartat s’inclourà, per a cada mostra, directament el resultat i la proposta de noves anàlisis (no cal que siguin de les mostres) per aportar noves proves al cas. Per exemple, si el teixit és pulmonar caldrà verificar si el culpable té una ferida recent en aquest òrgan.

També s’hi inclourà una reflexió sobre el cas basant-se en els resultats.

Màxim mitja pàgina

6. BIBLIOGRAFIA

Com a mínim dues cites bibliogràfiques, que a més han d’estar citades en el text.

Girona, ....... de ............ de 20.....

Nom i cognoms

Signatura

CAS 2. Determinació cromosòmica 11

4.Determinacio cromosòmica

En aquesta sessió d’aula es completarà un cariotip humà a partir de l’estudi d’una imatge que correspon a una extensió cromosòmica tenyida amb Giemsa, de manera que es pot observar el patró de bandes característic de cada parell de cromosomes. S’aprendrà a identificar i agrupar els cromosomes i detectar la presència d’anomalies.

4.1. INTRODUCCIÓ

4.1.1. El cariotip humà

El cariotip és la composició cromosòmica particular d’un individu, i es defineix segons el nombre de cromosomes en la metafase de la mitosi i la seva morfologia.

El cariotip humà consta de 2 n = 46 cromosomes, distribuïts en 22 parells d’autosomes i dos cromosomes sexuals, XX en el cas de la dona i XY en el cas de l’home. La dotació cromosòmica d’un individu s’indica amb el nombre total de cromosomes seguit dels cromosomes sexuals que presenta. Així, per exemple, per a un home i per a una dona normals s’indica “46, XY” i “46, XX”, respectivament.

4.1.2. Classificació dels cromosomes

Aplicant tècniques estàndard de tinció, els cromosomes apareixen en microscòpia òptica tenyits uniformement en la metafase. Segons la seva longitud i la posició del centròmer, la regió d’unió de les dues cromàtides, els autosomes es classifiquen en 7 grups: A, B, C, D, E, F i G. Els cromosomes sexuals constitueixen un grup a part, tot i que per la seva mida el cromosoma X s’inclouria dins el grup C, ja que és semblant al 6, i el cromosoma Y dins el grup G, tot i que sense presentar satèl·lits.

Grup Parelles Característiques

A 1, 2 i 3

Són els cromosomes metacèntrics més grans. Es poden diferenciar per la posició del centròmer.

B 4 i 5

Són els cromosomes submetacèntrics més grans, amb els dos braços de mida molt diferent.

C 6, 7, 8, 9, 10, 11 i 12

Són cromosomes mitjans submetacèntrics. Molt difícils de diferenciar amb tinció uniforme.

4. DETERMINACIÓ CROMOSÒMICA

CAS 2. Determinació cromosòmica 13

4.2. ELABORACIÓ D’UN CARIOTIP HUMÀ

4.2.1. Obtenció de la mostra d’estudi

Qualsevol mostra de teixit humà o raspats epitelials pot potencialment ser útil a l’hora de fer un cariotip, però per tal de facilitar l’estudi i augmentar-ne la qualitat i fiabilitat és recomanable partir d’una mostra de cèl·lules cultivades.

A partir d’una gota de sang en un petit volum de medi de cultiu, incubat a 37ºC durant 3 dies, es pot obtenir una mostra òptima per observar un elevat nombre de divisions mitòtiques que ens permetin obtenir una bona imatge amb la qual treballar. També resulta útil la utilització d’agents com la demecolcina, que aturen el cicle cel·lular en la metafase i permeten tenir una població cel·lular majoritària en la fase de condensació cromosòmica màxima.

4.2.2. Preparació de la mostra

Abans de l’observació al microscopi, cal fixar i muntar en un portaobjectes la mostra cel·lular. Les cèl·lules cultivades es renten diverses vegades amb una solució hipotònica per tal d’eliminar les restes de medi i es resuspenen en una solució fixadora, generalment una solució 3:1 metanol – àcid acètic.

Una gota d’aquesta suspensió llançada des d’una certa altura es deixa assecar sobre un portaobjectes rentat prèviament amb etanol i assecat en una estufa a 60ºC.

4.2.3. Tinció per bandes G

En aquesta tinció s’utilitza el colorant Giemsa sobre cèl·lules tractades amb tripsina. La tripsina és una proteasa que degradarà parcialment les proteïnes associades als cromosomes metafàsics. En aplicar el colorant, les zones dels cromosomes riques en adenina i timina (generalment zones pobres en gens) apareixen fortament tenyides, mentre que la resta de zones del cromosoma es tenyeixen de manera més suau (Figura 2.2). Com que el patró que s’obté és específic de cada parella de cromosomes, la identificació i classificació es facilita molt en comparació dels mètodes de tinció uniforme.

Figura 2.2. Identificació i classificació dels cromosomes per parelles

CAS 2. Determinació cromosòmica 14

Un sobretractament amb tripsina farà aparèixer els cromosomes borrosos, la qual cosa dificultarà el reconeixement correcte de les bandes, mentre que un tractament insuficient provocarà un contrast baix, de manera que les bandes no es diferenciaran i la identificació dels cromosomes no serà possible. Els cromosomes correctament tripsinitzats seran observats amb un patró de bandes G clares i ben contrastades.

4.3. ANOMALIES CROMOSÒMIQUES

4.3.1. Citogenètica clínica

L’any 1956 es va determinar que les cèl·lules humanes tenen una dotació cromosòmica de 2 n = 46. Només tres anys més tard es va identificar la primera malaltia que té el seu origen en una alteració del nombre de cromosomes, la síndrome de Down. Els individus que presenten aquesta anomalia cromosòmica o cromosomopatia tenen tres còpies del cromosoma 21, cosa que es coneix amb el nom de trisomia.

La majoria d’anomalies cromosòmiques impliquen un fetus inviable, però hi ha uns pocs casos que es poden arribar a desenvolupar fins al naixement.

De manera general, les anomalies cromosòmiques es classifiquen en estructurals, si afecten l’ordenació lineal dels gens (delecions, duplicacions, inversions i translocacions), i numèriques, si afecten el nombre de cromosomes (poliploïdies, trisomies, monosomies...). D’altra banda, segons si afecten els autosomes o els cromosomes sexuals, les cromosomopaties es classifiquen en autosòmiques i sexuals.

4.3.2. Anomalies autosòmiques

Les més freqüents en humans són la síndrome de Down (trisomia del cromosoma 21), la síndrome de Patau (trisomia del 13), la síndrome d’Edwards (trisomia del 18), la síndrome Cri du Chat (deleció del braç curt del cromosoma 5), la síndrome de DiGeorge (deleció parcial del braç llarg del cromosoma 22) i el cromosoma Filadèlfia (translocació entre els cromosomes 9 i 22).

4.3.3. Anomalies dels cromosomes sexuals

En humans podem trobar la síndrome de Klinefelter (poliploïdies del cromosoma X en homes: XXY, XXXY, XXXXY), la síndrome XYY (un cromosoma Y extra en homes), la síndrome de Turner (un únic cromosoma X: X0) i la síndrome XXX (un cromosoma X extra en dones).

4.3.4. Implicacions

Actualment tenim els mitjans que possibiliten la detecció abans del naixement d’aquestes (i altres) anomalies. Això ha comportat un interessant debat ètic i legal que sobrepassa l’àmbit purament científic.

CAS 2. Determinació cromosòmica 16

4.5. INFORME DE LABORATORI

Codi del cariotip de treball

#__________

Sexe

Home  Dona 

Anomalies cromosòmiques

Estructural Sí  No 

Deleció  Duplicació  Inversió  Translocació 

Numèrica Sí  No 

Autosòmica 

Síndrome de Down  Síndrome de Patau 

Sexual 

Síndrome de Klinefelter  Síndrome XYY  Síndrome de Turner  Síndrome XXX 

PRÀCTICA: CAS 2

DETERMINACIÓ CROMOSÒMICA

CAS 2. Anàlisi de fàrmacs 17

5.Identificacio i quantificació de fàrmacs

En aquesta sessió de pràctiques identificarem mitjançant una cromatografia de capa prima quin fàrmac té una mostra problema entre les substàncies àcid acetilsalicílic, cafeïna, ibuprofèn i paracetamol, mitjançant la comparació amb patrons purs d’aquestes substàncies. Un cop identificat el fàrmac, el quantificarem emprant una determinació espectrofotomètrica. El desenvolupament de la pràctica ens permetrà familiaritzar-nos amb una de les tècniques cromatogràfiques més versàtils per a la identificació de compostos: la cromatografia de capa fina. A més, consolidarem els coneixements en determinacions espectrofotomètriques ja abordats en el cas 1.

5.1. INTRODUCCIÓ

5.1.1. CROMATOGRAFIA

La cromatografia és un mètode físic de separació en el qual els components per separar es distribueixen entre dues fases, una de les quals és estacionària (fase estacionària), mentre que l’altra (fase mòbil) es mou en una direcció definida.

5.1.1.1. TÈCNIQUES CROMATOGRÀFIQUES

Els mètodes cromatogràfics es poden classificar segons:

a) la forma del llit cromatogràfic

Cromatografia en columna Tècnica de separació en la qual el llit estacionari es troba dins d’un tub. Les partícules de la fase sòlida estacionària o el suport envoltat d’una fase estacionària líquida poden omplir completament el tub ( packed column , columna reblerta) o estar concentrats tot al llarg de les parets deixant un camí lliure per a la fase mòbil a la part central ( open-tubular column ).

Cromatografia plana Tècnica de separació en la qual la fase estacionària és present com un pla o sobre un pla. El pla pot ser paper, que serveix com a tal o està impregnat amb una substància que actua de llit estacionari ( paper chromatography , cromatografia sobre paper), o una capa de partícules sòlides estesa o col·locada sobre una placa inerta, per exemple de vidre ( thin layer chromatography, cromatografia de capa prima).

b) l’estat físic de la fase mòbil

Les tècniques cromatogràfiques es classifiquen sovint especificant l’estat físic de les dues fases que s’utilitzen. Segons aquesta classificació s’utilitzen els termes següents:

Cromatografia gas-líquid ( gas-liquid chromatography (GLC)) Cromatografia gas-sòlid ( gas-solid chromatography (GSC)) Cromatografia líquid-líquid ( liquid-liquid chromatography (LLC)) Cromatografia líquid-sòlid ( liquid-solid chromatography (LSC))

5. IDENTIFICACIÓ I QUANTIFICACIÓ

DE FÀRMACS

CAS 2. Anàlisi de fàrmacs 19

La separació es basa principalment en efectes d’exclusió, com ara diferències en la mida i/o forma de les molècules o en la seva càrrega (Figura 2.6).

Figura 2.6. Cromatografia d’exclusió (http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/CHROMO/be_types.htm)

Cromatografia d’afinitat ( affinity chromatography ) Aquesta expressió caracteritza una variant particular de la cromatografia en la qual la interacció específica biològica d’unió lligand-anàlit s’utilitza per a la separació (Figura 2.7).

Figura 2.7. Cromatografia d’afinitat (http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/CHROMO/be_types.htm)

La cromatografia és una tècnica de separació extraordinàriament versàtil que permet separar una mescla homogènia basada en les diferències en l’equilibri de distribució de diverses substàncies dissoltes entre dues fases. Cada component de la mescla experimenta un equilibri de distribució entre les dues fases. Un component que es troba principalment en la fase mòbil es mou més ràpidament que un component que mostra més afinitat per la fase estacionària. D’aquesta manera sorgeix una diferència en la velocitat de moviment dels compostos i per tant aquests es poden separar.

Petites molècules penetren en els porus de les partícules

Les molècules de mida gran estan excloses

La fase estacionària té afinitat per un sol tipus de molècula, que s’hi uneix mitjançant un enllaç covalent

Totes les altres molècuiles simplement són rentades.

CAS 2. Anàlisi de fàrmacs 20

5.1.1.2. Cromatografia de capa prima (CCP) / thin layer cromatography

(TLC)

Consideracions generals

La cromatografia de capa prima és una de les formes més simples de cromatografia. Segons les classificacions que acabem de mostrar, és una cromatografia plana segons la forma del llit cromatogràfic, és una cromatografia líquid-sòlid segons l’estat físic de les fases i segons el mecanisme de separació que utilitza és una cromatografia d’adsorció.

La cromatografia de capa prima (Figura 2.8) és un procediment senzill, ràpid i econòmic que permet saber quants components hi ha en una mescla, i també es pot utilitzar per identificar un compost en una mostra problema quan el seu comportament és comparat amb el d’un o diversos patrons.

A B M

A = patró A B = patró B M = mostra

(I) (II) (III)

Figura 2.8. Cromatografia de capa prima

-En aquesta tècnica cromatogràfica la fase mòbil, és a dir, el dissolvent que s’anomena eluent , avança per la fase estacionària, l’adsorbent, per acció capil·lar. L’adsorbent, anomenat capa fina , està format per una capa d’adsorbent (generalment sílice o alúmina) d’espessor uniforme dipositada sobre un suport sòlid (plàstic, alumini o vidre). Una petita quantitat de la mostra per analitzar s’aplica prop de la part inferior de la placa. La placa de cromatografia de capa prima (CCP) es col·loca en una cambra d’elució contenint un cert volum de dissolvent, de manera que només la part més inferior de la placa estigui submergida. El líquid o eluent és la fase mòbil que puja lentament per la placa de CCP mitjançant l’acció capil·lar.

Quan l’eluent passa a través de la taca de mostra que s’ha aplicat, s’estableix un equilibri per a cada un dels components de la mescla entre les molècules d’aquest component que estan adsorbides al sòlid i les molècules que hi ha en solució. En principi, els components difereixen en solubilitat i en la força de la seva adsorció amb l’adsorbent i alguns components estaran més allargassats per la placa que uns altres. Quan l’eluent hagi arribat a la part superior de la placa, la placa es treu de la cambra d’elució i s’eixuga, i els components de la mostra separats es poden visualitzar. Si els compostos tenen color, la visualització és directa. Tanmateix, la majoria de vegades els compostos no tenen color i cal una làmpada UV per tal de visualitzar la placa (la mateixa placa conté un fluoròfor que emet fluorescència en tota placa excepte als llocs on hi ha un compost orgànic).