¡Descarga Practicas de toxicologia y más Ejercicios en PDF de Toxicología solo en Docsity!
7 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
7.1 Determinación del p-nitrofenol liberado
Como se muestra en la figura anterior, la hidrólisis enzimática de paraoxon genera p-nitrofenol. La cantidad de p-nitrofenol liberado se utilizará para monitorizar y cuantificar la hidrólisis del paraoxon. Cuando el p-nitrofenol se desprotona forma el ion p-nitrofenolato, que es un compuesto de color amarillo y que, por lo tanto, absorbe a una longitud de onda entorno a 400 nm.
Preparación de los patrones de la curva de calibración a partir de una disolución 100 μM de p-nitrofenol en Tris 50 mM pH 8. Concentración de p-nitrofenol (μM) 0 10 20 30 40 50 60 70
Volumen disolución madre (mL) 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,
Volumen Tris 50 mM pH 8.0 (mL) 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,
Resultados experimentales
Nº Absorbancia de los patrones Medida 0 μM 10 μM 20 μM 30 μM 40 μM 50 μM 60 μM 70 μM 1 0’219 0’496 0,796 0’990 1,370 1,520 1, 2 3 Pendiente del modelo lineal (y = ax) Media 10 μM 20 μM 30 μM 40 μM 50 μM 60 μM 70 μM 1 2
Determine la absorbancia a 400 nm de los patrones de p-nitrofenol (0 – 70 μM). Se representará la absorbancia de los patrones de p-nitrofenol frente a la concentración conocida de dichos patrones, para construir una curva de calibrado. A partir de esta y de las absorbancias de las muestras, se calculará la concentración de p-nitrofenol (ANEXO I).
Recta: Y=0, R2=0’
PAGE 7
7.2 Reactivación por Ca 2+^ de la actividad paraoxonasa de suero de conejo inhibida por EDTA.
Se inhibirá la actividad paraoxonasa de suero de conejo incubando la enzima con EDTA a diferentes tiempos (0, 5 y 30 min). Tras ello, se tratará de reactivar la enzima adicionando Ca 2+ suficiente para neutralizar el EDTA. Inicie el programa de tiempos que se muestra a continuación en tres tubos (tubo 1, 2 y 3) manteniéndolos a 37ºC.
- Prepare tres tubos de ensayo con la siguiente mezcla (Ver programa de tiempos 1):
Volumen suero conejo (1:10) Volumen Tris 100 mM p H 8.0 Volumen EDTA 5 mM (μL) (μL) (μL) 100 2000 100
2) Incube las mezclas anteriores a 37 °C durante: a) 0 minutos; b) 5 minutos y c) 30 minutos, respectivamente.
- Tras el tiempo de incubación fijado en cada caso añada 800 μL de Ca 2+^ 5 mM.
- Incube las mezclas a 37 °C durante 10 minutos.
- Añada a cada tubo 1000 μL de paraoxon 4 mM. Inmediatamente después de la adición de paraoxon agite y registre la absorbancia a 400 nm de la mezcla.
- Incube las mezclas a 37 °C durante 15 minutos. Tras este tiempo registre de nuevo su absorbancia a 400 nm. Reactivación por Ca2+ de la actividad paroxonasa de suero de conejo inhibida por EDTA Tubo Absorbancia [p-nitrofenol ] Actividad enzimática relativa 1 2 C1 (μM) C2 (μM) (^) Δ (μM) (μmol min-1 mL-1) 1 (0 min) 0,17 0,8 6,8 32 25,2 0, 2 (5 min) 0,1 0,68 4 27,2 23,2 0, 3 (30 min) 0,08 0,42 3’2 16 12,8 0,
PAGE 7
7.3 Efecto del Cu 2+^ sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo.
Se determinará como afecta a la actividad paraoxonasa la incubación a 37 °C de suero de conejo con Cu 2+^ 1 mM durante 60 minutos
- Prepare mezclas que contengan 10 μL de suero de conejo en un medio Tris 50 mM pH 8.0 / Ca2+^ 0.5 mM conteniendo Cu2+^ 1 mM. Para ello siga el protocolo que se indica a continuación (Ver programa de tiempos 2). El tiempo inicial coincide con la adición de Ca 2+ en el tubo 1. Un minuto después, añadir Cu2+^ en el tubo 2.
Volumen suero conejo (1:10)
Volumen Tris 100 mM pH 8.
Volumen H2O
Volumen Ca2+^ 5 mM
Volumen Cu 2+^ 5 mM
Tubo (μL) (μL) (μL) (μL) (μL)
1 100 2000 600 300 F 02 D
2 100 2000 0 300 600
- Incube a 37 °C durante 60 minutos las mezclas anteriores.
- Añada a cada tubo 1000 μL de paraoxon 4 mM. Inmediatamente después de la adición de paraoxon agite y registre la absorbancia de la mezcla a 400 nm.
- Incube las mezclas a 37 °C durante 15 minutos. Tras este tiempo registre de nuevo su absorbancia a 400 nm.
Efecto del Cu2+ sobre la actividad paroxonasa de suero de conejo Tubo Absorbancia [p-nitrofenol Actividad enzimática relativa 1 2 C1 (μM) C2 (μM) (^) Δ (μM) (μmol min-1 mL-1) Cu1 (control) 0,157 0,690 6,28 27,6 21,32 0, Cu2 (tratamiento) 0,139 0,327 5,56 13,8 7,52 0,
PAGE 7
7.4 Efecto de reactivos bloqueantes de grupos tioles sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo.
Se determinará como afecta a la actividad paraoxonasa la incubación a 37 °C de suero de conejo con p-hidroximercuriobenzoato 1 mM durante 60 minutos
- Preparar una disolución de p-hidroximercuriobenzoato (p-OHMB) 5 mM en agua.
- Prepare mezclas que contengan 10 μL de suero de conejo en un medio Tris 50 mM pH 8.0/Ca2+^ 0.5 mM conteniendo p-OHMB 1 mM. Para ello siga el protocolo que se indica a continuación (Ver programa de tiempos 2). El tiempo inicial coincide con la adición de Ca2+^ en el tubo 1. Un minuto después, añadir p-OHMB en el tubo 2.
Volumen suero conejo (1:10)
Volumen Tris 100 mM pH 8.
Volumen H2O
Volumen Ca 2+ 5 mM
Volumen p-OHMB 5 mM
Tubo (μL) (μL) (μL) (μL) (μL)
1 100 2000 600 300 F 02 D
2 100 2000 0 300 600
- Incube a 37 °C durante 60 minutos las mezclas anteriores.
- Añada a cada tubo 1000 μL de paraoxon 4 mM. Inmediatamente después de la adición de paraoxon agite y registre la absorbancia de la mezcla a 400 nm.
- Incube las mezclas a 37 °C durante 15 minutos. Tras este tiempo registre de nuevo su absorbancia a 400 nm.
Efecto de reactivos bloqueantes de grupos tioles sobre la actividad paroxonasa Tubo Absorbancia [p-nitrofenol] Actividad enzimática relativa 1 2 C1 (μM) C2 (μM) (^) Δ (μM) (μmol min-1 mL-1) MB 1 (control) 0,184 0,869 7,36 34,4 27,04 0, MB 2 (tratamiento) 0,175 0,265 7 10,6 3’6 0,
PAGE 7
8 INFORME FINAL
Elabore un informe final sobre el trabajo realizado, incluyendo las respuestas a las cuestiones que se plantean a continuación. Añada cualquier otro comentario que considere pertinente.
(1) En el experimento de reactivación por Ca 2+, ¿Cuál es la razón concentración de EDTA / concentración de calcio en el volumen de reacción enzimática? Representar en una figura de barras la actividad enzimática en función del tiempo de incubación en presencia de EDTA. ¿Qué se observa? ¿Cómo podría justificar estos resultados?
El Ca2+ actúa como cofactor de la paroxonasa, este a su vez se une con el EDTA. A mayor tiempo de presencia de EDTA la acción con los cationes bivalentes de calcio será mayor y por tanto menor debería ser la actividad de la paroxonasa. Y la relacion es de 1/8.
(2) Represente en una gráfica de barras las actividades enzimáticas de las muestras control y ensayadas en presencia de Cu2+^ 1 mM. ¿Cuál es el efecto del Cu 2+? ¿Cómo podría justificar estos resultados?
Teóricamente el efecto del cobre sobre la acción de la paroxosonasa es inhibitoria sobre la enzima ya que al ser también un catión divalente, desplaza al calcio del centro activo de la enzima, bajando la actividad de la misma.
(3) Represente en una gráfica de barras las actividades enzimáticas de las muestras control y ensayadas en presencia de p-hidroximercuriobenzoato 1 mM. ¿Cuál es el efecto del p- hidroximercuriobenzoato? ¿Cómo podría justificar estos resultados?
Teóricamente, al reaccionar el pOHMB con un residuo de cisteína del centro activo de la enzima produce el bloqueo de esta. Por lo tanto la actividad de la misma debería disminuir.
(4) Represente en una gráfica de barras las actividades enzimáticas de las muestras control y ensayadas en presencia de EDTA 1 mM. ¿Cuál es el efecto del EDTA sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo? ¿Cómo se justifican estos resultados?
El EDTA es un agente quelante de cationes divalentes (como se explicó en el primer apartado). Así pues, quela el Ca2+ no dejando que actúe como cofactor de la enzima. Por lo tanto produciendo una bajada en la actividad de la misma
PAGE 7
Introduciendo el valor calculado F 0 4 4c en la Exp. 4 y sustituyendo el valor del volumen total de reacción obtenemos la actividad enzimática a partir de los datos de absorbancia y tiempo obtenidos en el laboratorio.
Con el objeto de calcular la actividad enzimática relativa al volumen de suero utilizado (medido en mL) emplearemos la expresión:
(Exp. 6)
Donde V (^) s es el volumen de suero utilizado inicialmente. Sustituyendo la actividad enzimática (Act) de la Exp. 4 en la Exp. 6 obtenemos:
(Exp. 7)
PAGE 7
