Practicas genetica, Ejercicios de Farmacia

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Área de Genética

Departamento de Biología Aplicada

Universidad Miguel Hernández

Grado en Farmacia

Curso 2013-

Práctica 1.- Análisis de segregaciones en Drosophila melanogaster I

1.1.- Consecuencias genéticas de la meiosis y la fecundación

En esta parte de la práctica, el alumno deberá familiarizarse con el dimorfismo sexual en Drosophila melanogaster , aprendiendo a distinguir a

los machos ( m ) de las hembras ( h ) (Figura 1). Los

machos son de menor tamaño que las hembras, presentan peines sexuales en las patas anteriores y una pigmentación oscura de sus últimos segmentos abdominales. A continuación, se procederá a distinguir los machos de las hembras en la preparación, an base a sus diferencias morfológicas.

Figura 1

A continuación, se analizará la transmisión de dos alelos de un gen autosómico, el gen vestigial , cuyo producto es necesario para el desarrollo del ala de la mosca. Para ello, se estudiará una preparación que contiene dos tipos de individuos, a los que se denomina P 1 y P 2 (Figura 2), cada uno de los cuales es homocigótico para uno de los dos alelos del gen vestigial ( vg + , que determina alas normales, y vg , que determina alas vestigiales). Los individuos P 1 presentan alas normales (fenotipo vg +) y los P 2 alas vestigiales (fenotipo vg).

El alumno deberá estudiar la preparación y aprender a distinguir las moscas con alas normales (fenotipo vg +), de las moscas con alas vestigiales (fenotipo vg).

A continuación, se estudiará una preparación que contiene individuos de la descendencia F 1 de un cruzamiento P 1 x P 2 , respondiendo a las siguientes preguntas:

¿Cuál es el genotipo de los gametos que pueden generar los parentales P 1 y P 2 durante la meiosis?

P 1 P 2

¿Cuál es el fenotipo de la descendencia F 1 de un cruzamiento P 1 x P 2?

 alas largas (normales).  alas medianas.  alas cortas.

Por tanto, puede afirmarse que:  el alelo que determina alas normales ( vg + ) es dominante respecto al que causa alas cortas ( vg ).  el alelo que causa alas normales ( vg+ ) es recesivo respecto al alelo que determina alas cortas ( vg ).  ambos alelos dan lugar a dominancia incompleta (herencia intermedia).

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Figura 2

P 1 P 2

vg

+ vg

1.3.-Cruzamiento de prueba Se denomina cruzamiento de prueba al cruzamiento entre un individuo y el homocigoto recesivo (individuo de prueba). En esta práctica se va a realizar el estudio de un cruzamiento de prueba entre individuos de fenotipo silvestre (todos con el mismo genotipo) e individuos de prueba de alas vestigiales. Este cruzamiento nos permitirá determinar el genotipo de los individuos de fenotipo silvestre.

¿Cuál es el genotipo del individuo de prueba de alas vestigiales?

¿Cuál es el genotipo de los gametos que puede generar el individuo de prueba y en qué proporciones?

Se estudiarán a continuación varias preparaciones (rotuladas como Serie 1, Mono, F (^2) BC ), que contienen la descendencia del cruzamiento de prueba antes comentado. En cada una de ellas se deberá determinar el número de individuos de cada uno de los fenotipos que aparecen:

Fenotipo vg +^ vg Preparación Preparación Preparación Preparación Preparación Preparación Total Segregación

Completa el siguiente cuadro de Punnett con las proporciones gaméticas de los individuos implicados en el cruzamiento de prueba, así como con las fenotípicas y genotípicas obtenidas en el cruzamiento:

m silvestre h Indiv. Prueba

MEIOSIS

MEIOSIS

SEGREGACIÓN

FENOTÍPICA

Indica cuál es el genotipo de los individuos de fenotipo silvestre que se han cruzado con los individuos de prueba.

FECUNDACION

1.4.- Herencia del gen white En esta parte de la práctica se analizará la transmisión de un alelo mutante del gen white , el alelo w. Dicho alelo determina una coloración blanca de los ojos de la mosca, que son rojos en los individuos normales. El alumno deberá estudiar la preparación rotulada como Serie 4 H. L. Sex P, observando que existen diferentes fenotipos, e indicando a continuación todos los que encuentre:

 machos de ojos rojos  machos de ojos blancos  hembras de ojos rojos  hembras de ojos blancos

Se ha realizado un cruzamiento entre una hembra silvestre de ojos rojos y un macho de ojos blancos_._ ¿Cuál es el fenotipo de su descendencia F 1?  ojos rojos  ojos blancos  ojos rosas

Por tanto, se puede afirmar que:  el alelo responsable de las ojos blancos ( w ) es dominante.  el alelo responsable de los ojos rojos ( w + ) es dominante.  ambos alelos dan lugar a dominancia incompleta (herencia intermedia).

Se ha realizado un cruzamiento entre una hembra de ojos blancos y un macho de ojos rojos_._ ¿Cuál es el fenotipo de su descendencia F 1 (preparaciones rotuladas como Serie 4 H. L. Sex F 1 b )?

 ojos rojos  ojos blancos

Además del color de los ojos, ¿observas alguna diferencia fenotípica adicional entre los individuos de ojos blancos y los de ojos rojos?

Formula una hipótesis genética que justifique el fenómeno observado:

Se estudiarán a continuación las preparaciones rotuladas como Serie 4 H. L. Sex F 1 b ), que contienen indivi- duos de la F 1 del cruzamiento entre una hembra de ojos blancos y un macho de ojos rojos. En cada una de ellas se deberá determinar el número de individuos de cada uno de los fenotipos que aparecen:

Fenotipo

h w +^ m w +^ h w m w

Preparación Preparación Preparación Preparación Preparación Preparación Total Proporción

En Drosophila melanogaster , al igual que en la especie humana, la determinación del sexo es cromosómica y del tipo XX/XY. La dotación cromosómica sexual de la hembra es XX, siendo uno de sus cromosomas X de origen materno, y el otro, paterno. ¿Qué tipo de gametos puede producir una hembra, en relación a los cromosomas sexuales, y con qué probabilidad?

Práctica 2.- Análisis de segregaciones en Drosophila melanogaster II

2.1.- Cruzamiento de prueba con dos genes. Segregación independiente de genes. A continuación, se analizará la transmisión de los alelos de dos genes autosómicos, el gen vestigial , cuyo producto es necesario para el desarrollo del ala de la mosca, y el gen ebony , que está implicado en el color de la cutícula. Para ello, se estudiará una preparación que contiene dos líneas puras parentales, a las que se denomina P 1 y P 2. Los individuos P 1 presentan alas normales (fenotipo vg +) y cutícula normal de color marrón (fenotipo eb +), y los P 2 alas vestigiales (fenotipo vg) y cutícula de color negro (fenotipo eb).

El alumno deberá estudiar la preparación y aprender a distinguir las moscas con alas normales (fenotipo vg +) y cutícula normal marrón (eb +), de las moscas con alas vestigiales (fenotipo vg) y cutícula negra (fenotipo eb).

A continuación, se estudiará una preparación que contiene individuos de la descendencia F 1 de un cruzamiento P 1 x P 2 , respondiendo a las siguientes preguntas:

¿Cuál es el genotipo de los gametos que pueden generar los parentales P 1 y P 2 durante la meiosis?

P 1 P 2

¿Cuál es el fenotipo de la descendencia F 1 de un cruzamiento P 1 x P 2?

Por tanto, puede afirmarse que:  el alelo que determina alas normales ( vg + ) es dominante respecto al que causa alas cortas ( vg ).  el alelo que causa alas normales ( vg+ ) es recesivo respecto al alelo que determina alas cortas ( vg ).  el alelo que determina cutícula normal ( eb + ) es dominante respecto al que causa cutícula negra ( eb ).  el alelo que causa cutícula normal ( eb + ) es recesivo respecto al alelo que determina cutícula negra ( eb ).

Indica cuál de los tres genotipos que aparecen en la tabla es el de los individuos P 1 , P 2 y F 1 , respectivamente.

Genotipo Individuos P 1 P 2 F 1 vg+^ vg+ Gen vestigial vg vg vg+^ vg

eb+^ eb+ Gen ebony eb eb eb+^ eb

Indica, a continuación, el genotipo completo (para los dos genes) de un individuo de la F 1 :

F 1

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¿Cuál es el genotipo de los gametos que puede generar un individuo de la F 1 y en qué proporciones?

En esta práctica, se va a realizar el estudio de un cruzamiento de prueba entre hembras de fenotipo silvestre procedentes de la F 1 e individuos de prueba machos de alas vestigiales y cutícula negra.

¿Cuál es el genotipo del individuo de prueba de alas vestigiales y cutícula negra?

¿Cuál es el genotipo de los gametos que puede generar el individuo de prueba y en qué proporciones?

Se estudiarán a continuación varias preparaciones (rotuladas como Serie 2 Rec.Inter F2BC ), que contienen la descendencia del cruzamiento de prueba antes comentado. En cada una de ellas se deberá determinar el número de individuos de cada uno de los fenotipos que aparecen:

Fenotipo vg +^ eb+^ vg eb vg +^ eb vg eb+ Preparación Preparación Preparación Preparación Preparación Preparación Total Segregación

Completa el siguiente cuadro de Punnett con las proporciones gaméticas de los individuos implicados en el cruzamiento de prueba, así como con las fenotípicas y genotípicas obtenidas en la F 2 :

h (silvestre) m (ind. de prueba)

FENOTIPOS

Comprueba tu hipótesis mediante la realización del test de χ^2.

Clases fenotípicas Observados Esperados (O-E) 2 /E

Total = χ^2 =

2.2.- Cruzamiento de prueba con dos genes. Análisis de ligamiento entre genes. A continuación, se analizará la transmisión de los alelos de dos genes autosómicos, el gen vestigial , cuyo producto es necesario para el desarrollo del ala de la mosca, y el gen black , que está implicado en el color de la cutícula. Para ello, se estudiará una preparación que contiene dos líneas puras parentales, a las que se denomina P 1 y P 2. Los individuos P 1 presentan alas normales (fenotipo vg +) y cutícula normal de color marrón (fenotipo b +), y los P 2 alas vestigiales (fenotipo vg) y cutícula de color negro (fenotipo b).

El alumno deberá estudiar la preparación y aprender a distinguir las moscas con alas normales (fenotipo vg +) y cutícula normal marrón (b +), de las moscas con alas vestigiales (fenotipo vg) y cutícula negra (fenotipo b).

A continuación, se estudiará una preparación que contiene individuos de la descendencia F 1 de un cruzamiento P 1 x P 2 , respondiendo a las siguientes preguntas:

¿Cuál es el genotipo de los gametos que pueden generar los parentales P 1 y P 2 durante la meiosis?

P 1 P 2

¿Cuál es el fenotipo de la descendencia F 1 de un cruzamiento P 1 x P 2?

Por tanto, puede afirmarse que:  el alelo que determina alas normales ( vg + ) es dominante respecto al que causa alas cortas ( vg ).  el alelo que causa alas normales ( vg+ ) es recesivo respecto al alelo que determina alas cortas ( vg ).  el alelo que determina cutícula normal ( b + ) es dominante respecto al que causa cutícula negra ( b ).  el alelo que causa cutícula normal ( b+ ) es recesivo respecto al alelo que determina cutícula negra ( b ).

Indica, a continuación, el genotipo completo de un individuo de la F 1 :

F 1

¿Cuál es el genotipo de los gametos que puede generar un individuo de la F 1?

En esta práctica, se va a realizar el estudio de un cruzamiento de prueba entre hembras de fenotipo silvestre procedentes de la F 1 e individuos de prueba machos de alas vestigiales y cutícula negra.

¿Cuál es el genotipo del individuo de prueba de alas vestigiales y cutícula negra?

¿Cuál es el genotipo de los gametos que puede generar el individuo de prueba y en qué proporciones?

Se estudiarán a continuación varias preparaciones (rotuladas como Serie 3 Rec.Intra F2BC ), que contienen la descendencia del cruzamiento de prueba antes comentado. En cada una de ellas se deberá determinar el número de individuos de cada uno de los fenotipos que aparecen:

Fenotipo vg +^ b+^ vg b vg +^ b vg b+ Preparación Preparación Preparación Preparación Preparación Preparación Total Segregación

Comprueba la hipótesis de segregación independiente de los dos genes mediante la realización del test de χ^2.

Clases fenotípicas Observados Esperados (O-E) 2 /E

Total = χ^2 =

Indica el número de grados de libertad:

¿Se puede rechazar la hipótesis de segregación independiente de los dos genes o no?  Sí se rechaza  No se rechaza

¿Por qué?

¿Cuál es la explicación más plausible al resultado obtenido? ¿Crees o no que puede haber ligamiento?

¿Cuál sería la notación correcta para los individuos parentales y los de la F 1?

P 1 P 2

F (^1)

¿Cuál es el genotipo de los gametos que puede generar un individuo de la F 1? Indica cuáles son de naturaleza parental (P) y cuáles son recombinantes (R).

Práctica 3.- Aislamiento de plásmido recombinante y electroforesis

en geles de agarosa

3.1.- Aprendizaje del manejo de micropipetas Una característica común a la mayoría de las reacciones que se llevan a cabo en Ingeniería Genética es su pequeño volumen. El recipiente más utilizado es el denominado tubo eppendorf , usualmente de 1,5 mililitros, aunque también son comunes los de 500 y de 200 μl. La unidad de medida de volumen de uso más frecuente es el microlitro (μ l ). Las unidades de masa más empleadas son el microgramo (μ g ), el nanogramo ( ng ), e incluso, el picogramo ( pg ). Es conveniente, en primer lugar, familiarizarse con el uso de estas unidades.

Las medidas de volumen suelen llevarse a cabo con un instrumento denominado micropipeta (Figura 3). Se trata de un objeto que debe ser manejado con cuidado, no forzando nunca ninguno de sus elementos. Tal como se aprecia en la Figura 3, consta, entre otras, de las siguientes partes: (1) un pulsador y selector de volúmenes , con dos topes, el primero para aspirar o dosificar y el segundo, más abajo, para expulsar el volumen residual que permanece en la punta de la pipeta; (2) un expulsor de puntas ; (3) un visualizador digital del volumen seleccionado; (4) un casquillo de expulsión. El volumen de las disoluciones se estima en el interior de una punta de micropipeta , un componente desechable que se adosa al extremo inferior de la micropipeta, ejerciendo una ligera presión.

ATENCIÓN

El alumno debe familiarizarse con el manejo de la micropipeta, aprendiendo, en primer lugar, a llevar a cabo las manipulaciones que se indican a continuación, que irá marcando una a una en esta guía de la práctica, una vez se hayan realizado, señalando  los lugares en los que aparezca el símbolo .

En primer lugar, los alumnos se familiarizarán con los distintos tipos de micropipetas que se utilizarán en estas prácticas. La micropipeta de 1 ml (Figura 3) se emplea para volúmenes

comprendidos entre 100 y^ 1.000^ μl,^ aunque^ usualmente^ se emplea para volúmenes que van desde 200 a 1.000 μl. La micropipeta de 200 μl se utiliza para dispensar volúmenes desde 20 a 200 μl; y la micropipeta de 20 μl nos sirve para volúmenes que van desde 2 a 20 μl, aunque también se suele utilizar para volúmenes levemente inferiores, hasta 1 μl. Es importante identificar para cada pipeteo cuál es la micropipeta idónea, ya que la utilización de una micropipeta errónea nos llevará a un pipeteo incorrecto y/o a forzar y romper el instrumento.

1 ml = 0,001 l = 10 -3^ l 10 3 ml = 1.000 ml = 1 l 1 μl = 0,000001 l = 10-6^ l 10 6 μl = 1.000.000 μl = 1 l 1 μg = 10 -6^ g 1 ng = 10 -9^ g 1 pg = 10 -12^ g 1 g = 10 6 μg

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Figura 3

Micropipeta

Punta

Tubo

eppendorf

El líquido se pipetea a través de una punta de micropipeta adosada al extremo de la micropipeta. Las puntas azules son de mayor tamaño y se emplean con la micropipeta de 1 ml, mientras que las puntas amarillas sirven para las micropipetas de 200 y de 20 μl.

IMPORTANTE

Las puntas de micropipetas son desechables y de un solo uso. Una vez utilizadas deben eliminarse inmediatamente. Hay que manejarlas con cuidado, ya que se trata de material estéril. Para cualquier manejo a realizar en el laboratorio, nos pondremos guantes de látex, que tienen la utilidad tanto de proteger nuestras manos de posibles agentes agresivos como de proteger el material experimental de las nucleasas que portamos en nuestras manos.

 Tomar un tubo^ eppendorf^ vacío (de 1,5 ml), rotularlo

en su tapa con el número del grupo de prácticas, y pesarlo en una balanza, anotando su peso con la máxima precisión posible

 aprender a abrir y cerrar el tubo^ eppendorf^ de 1,5 ml

con una sola mano, -------------------------------------------------------------------------------------------------------- 

 distinguir los dos tipos de micropipetas (de 20 y 200^ μl)

que se usarán en esta práctica, --------------------------------------------------------------------------------------- 

 regular en una micropipeta de 200^ μl el volumen de la

disolución que se desea medir (95,0 μl), ---------------------------------------------------------------------------- 

 montar una punta de micropipeta, ------------------------------------------------------------------------------------^ 

 tomar una muestra de 95^ μl de agua,^ 

 observar^ la^ punta^ de^ la^ micropipeta,

comprobando que ha incorporado la muestra, -------------------------------------------------------------------------- 

 y^ que^ no^ contiene^ aire^ por^ debajo^ de^ la

muestra, --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 

 descargar^ dicha^ muestra^ en^ el^ fondo^ de^ un^ tubo

eppendorf , ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 

 desechar la punta que se ha usado, ---------------------------------------------------------------------------------^ 

 incorporar una punta nueva a la micropipeta, ----------------------------------------------------------------------^ 

 tomar una muestra de 125^ μl de agua,^ 

 observar^ la^ punta^ de^ la^ micropipeta,

comprobando que ha incorporado la muestra, -------------------------------------------------------------------------- 

 y^ que^ no^ contiene^ aire^ por^ debajo^ de^ la

muestra, --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 

 incorporar esta segunda muestra al interior del tubo, ------------------------------------------------------------^ 

 cerrar^ el^ tubo^ y^ mezclar^ adecuadamente^ ambas

muestras, 

 mediante su agitación en un agitador ( vortex ), ---------------------------------------------------------^ 

 y su centrifugación breve en una^ microfuga , -----------------------------------------------------------^ 

 pesar^ el^ tubo,^ anotando^ su^ peso^ con^ la^ máxima

precisión posible, --------------------------------------------------------------------------------------------------- 

 y comparar el peso inicial y el final.

¿Cuál es la diferencia entre el peso del tubo vacío y el tubo lleno? 

¿Cuál es el volumen de agua que debiera contener el tubo? 

¿Se han tomado correctamente las muestras? (responder SI o NO) ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 

4.- Unión del ADN plasmídico a la columna de sílice………….  Colocar el tubo que contiene la columna en un tubo colector de 2 ml. Cargar con la micropipeta de 200 μl un máximo de 700 μ l del sobrenadante resultante del paso 3 sobre la columna. Centrifugar durante 1 minuto a 11.000 rpm. Eliminar el contenido del tubo colector.

5.- Lavado de la columna de sílice……………………………….  Colocar de nuevo el tubo con la columna en el tubo colector. Añadir 500 μ l de tampón AW precalentado a 50 ºC y centrifugar durante 1 minuto a 11.000 rpm. Eliminar el contenido del tubo colector. Volver a colocar el tubo con la columna de sílice en el tubo colector. Añadir 600 μ l de tampón A4. Centrifugar durante 1 minuto a 11.000 rpm. Eliminar el contenido del tubo colector.

6.- Secado de la columna de sílice……..……………………….  Colocar una vez más el tubo con la columna en el tubo colector. Centrifugar durante 2 minutos a 11.000 rpm y desechar el tubo colector y su contenido.

7.- Elución del ADN plasmídico…………………………………..  Colocar el tubo que contiene la columna en un tubo eppendorf de 1,5 ml y añadir 50 μ l de tampón AE. Incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto. Centrifugar durante 1 minuto a 11.000 rpm. Desechar el tubo con la columna. El tampón que ha caído dentro del tubo eppendorf de 1,5 ml contiene el plásmido recombinante.

3.3.- Digestión enzimática de plásmidos Se llevará a cabo la linearización del plásmido recombinante, mediante digestión con una endonucleasa de restricción. Estas enzimas son capaces de reconocer secuencias específicas en el ADN ( dianas de restricción ), a las que se unen, cortando ambas cadenas. Las más comúnmente utilizadas reconocen secuencias de 4 o 6 pares de bases. Las enzimas de restricción que se utilizaron para la clonación del inserto en el vector fueron Hind III y Eco RI, de forma que aquél se ha introducido en el vector entre las respectivas dianas para estos dos enzimas.

5´---G-A-A-T-T-C---3´

3´---C-T-T-A-A-G---5´

Restricción  Eco RI ↓ 5´---G-3´ 5´-A-A-T-T-C---3´ 3´---C-T-T-A-A-5´ 3´-G---5´

Para comenzar esta parte de la práctica, el alumno estudiará el mapa del vector pGEM-3Zf(+) (Figura 5 de la página 21), que se empleó para la obtención del plásmido recombinante. En la secuencia

Cargar sobrenadante

1 minuto 11.000 rpm

+ 500 μ l AW 1 minuto 11.000 rpm

+ 600 μ l A 1 minuto 11.000 rpm

2 minutos 11.000 rpm

+ 50 μ l AE

Temperatura ambiente 1 minuto

1 minuto 11.000 rpm

del sitio de clonación múltiple ( polylinker ) del vector, identifica y señala las posiciones en las que se localizan las dianas de restricción para Eco RI y Hind III. Junto con cada endonucleasa de restricción, los fabricantes suministran un tampón de digestión cuyos componentes contribuyen a que la mezcla de reacción permita la actividad de la enzima. Los componentes de estos tampones suelen estar concentrados diez veces más de lo necesario en la mezcla de reacción, por lo que se dice que se encuentran a una concentración 10x , mientras que la digestión tiene que ocurrir a una concentración 1x. Un tampón 10x debe contribuir, por lo tanto, en 1/10 a la mezcla de reacción para que ésta alcance la concentración 1x ideal para la función de la enzima. Las enzimas suelen comercializarse en concentraciones de 10 u/μl (unidades/microlitro) o superiores. Para la digestión que se realizará en esta práctica son suficientes 2 unidades de enzima, por lo que las alícuotas suministradas se han obtenido diluyendo disoluciones comerciales de las enzimas en el propio tampón de digestión a concentración 1x. Cada grupo de prácticas realizará dos digestiones del pásmido recombinante. Empleando la micropipeta de 20 μl, se mezclarán en un tubo eppendorf de 1,5 ml, para obtener un volumen final de 20 μl, los siguientes componentes de la mezcla de reacción, indicando cada uno de los pasos que se han dado:

DIGESTION DEL PLASMIDO RECOMBINANTE (1):

 Tampón 10x para^ Hin dIII .............................................^2 μl --------------------------^ 

 ADN del plásmido recombinante^ .................................^3 μl --------------------------^ 

 H^2 O ............................................................................15^ μl --------------------------^ 

 Enzima^ Hin dIII^ 1 u/μl (diluido en tampón 1x)...............^2 μl --------------------------^ 

DIGESTION DEL PLASMIDO RECOMBINANTE (2):

 Tampón 10x para^ Hin dIII y^ Eco RI ...............................^2 μl --------------------------^ 

 ADN del plásmido recombinante^ .................................^3 μl --------------------------^ 

 H^2 O .............................................................................^15 μl -------------------------^ 

 Enzimas^ Hin dIII y^ Eco RI 1 u/μl de cada uno

(diluidos en tampón 1x) ................................................ 2 μl -------------------------- 

 cerrar los tubos y mezclar adecuadamente los componentes de las digestiones,

mediante su agitación en un agitador ( vortex )…………………………………………

 y su centrifugación breve en una^ microfuga ,……………………………………………..^ 

Las digestiones se incubarán durante toda la noche, a 37°C, en una estufa. Los tubos de las digestiones se recogerán de la estufa al día siguiente y se almacenarán en el congelador hasta el siguiente día de prácticas.

3.4.- Electroforesis de ADN en geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio El método de separación de moléculas de ADN de uso más frecuente es la electroforesis en geles de agarosa , un polisacárido cuyas propiedades son similares a las del agar. En la electroforesis, el gel se introduce en el interior de una cubeta que ha sido previamente rellenada con un electrolito (un tampón de electroforesis ). El gel se prepara previamente, disolviendo por calentamiento la agarosa en el tampón de electroforesis. Una vez sumergido el gel en la cubeta, se cargan las muestras en los pocillos del gel. A continuación, se conecta la cubeta a una fuente de alimentación y se aplica una corriente eléctrica. El ADN, una molécula de carga negativa, migra hacia el polo positivo del campo eléctrico generado por la fuente de alimentación. La velocidad de migración del ADN en un gel de agarosa depende de varios parámetros: el tamaño y la conformación de la molécula de ADN, la concentración de agarosa en el gel y el voltaje aplicado. Para visualizar las moléculas de ADN es necesario teñir el gel. Existen varios métodos de tinción, aunque el más comúnmente empleado es el que utiliza bromuro de etidio. Este agente intercalante presenta fluorescencia cuando es expuesto a la luz ultravioleta (312 nm), lo que posibilita la visualización de las moléculas de ADN en el gel.

A continuación, se procederá al desarrollo de una nueva electroforesis para verificar el resultado de la digestión doble del plásmido recombinante con las enzimas Eco RI y Hin dIII.

 Añadir al tubo eppendorf con la digestión del plásmido recombinante con las enzimas^ Eco RI

y Hin dIII 3 μl de tampón de carga---------------------------------------------------------------------------------- 

 Cargar 20^ μl del contenido del tubo eppendorf en uno de los pocillos del gel.------------------------------^ 

 Conectar los electrodos a la fuente de alimentación, colocando el de color rojo (polo

positivo) en el extremo opuesto a aquél en el que se cargó el ADN. ------------------------------------ --

 Poner en marcha la fuente de alimentación, regulándola a un voltaje constante de 100

voltios. --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 

Pegar la fotografía aquí

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Habiendo localizado previamente las dianas para las enzimas de restricción Eco RI y Hin dIII en el polylinker del vector pGEM-3Zf(+), sabiendo que éstas fueron las enzimas que se emplearon en la clonación del inserto en el vector y conociendo el resultado de las digestiones del plásmido recombinante con estas enzimas de restricción. Responde a las siguientes preguntas:

¿Qué migra más rápido en la electroforesis, una molécula de ADN circular o una de ADN lineal del mismo tamaño?

¿Por qué?

¿Cuántas dianas de restricción para Hin dIII contiene el plásmido recombinante utilizado?..................... ¿Cuántas dianas de restricción para Eco RI contiene el plásmido recombinante utilizado? ..................... ¿Cuántos fragmentos de restricción se obtendrán mediante la digestión del plásmido recombinante con Eco RI? .......................................................................................... ¿Cuántos fragmentos de restricción se obtendrán mediante la digestión del plásmido recombinante con Hin dIII y Eco RI? .................................................................................