PRÁCTICA L1. INHIBIDORES DE LA DIGESTIÓN
OBJETIVO
El objetivo es evaluar el contenido en inhibidores de tripsina en semillas de leguminosas.
PROCEDIMIENTO
Primero obtendremos el extracto de inhibidores de tripsina. Para esto moleremos las semillas
de leguminosa secas y una vez conseguida una harina fina, pesaremos de ésta 1 gramo y
añadiremos 50 ml de NaOH 0.01 N. Se mantendrá en agitación por 1 hora y cuando
comprobemos que su ph es básico (entre 8.4 y 10) lo centrifugaremos 15 minutos a 1000g
(aproximadamente 3000 rpm). Por último, recogeremos el sobrenadante.
Para la obtención del extracto de inhibidores de tripsina para la harina de soja se han
empleado 1.01 gramos de soja y para la harina de lenteja 1.1 gramos de lenteja.
En este caso, se ha evaluado el contenido en inhibidores de tripsina en semillas de lenteja.
Una vez recogido el sobrenadante, preparamos diluciones 1:10, 1:20, 1:30 y 1:40 del extracto
con agua mili-Q. Las 4 muestras las hemos preparado en matraces aforados de 10 mililitros,
por lo que hemos añadido los siguientes volúmenes:
Extracto I (1:10) Extracto II (1:20) Extracto III (1:30) Extracto IV (1:40)
Extracto lenteja (ml) 1 0.5 0.3 0.25
Agua mili-Q (ml) 9 9.5 9.6 9.75
Prepararemos 11 tubos de ensayo siguiendo la siguiente tabla:
Tubo Extracto Agua Inhibidor Tripsina BAPA
Tripsina (10 μg/ml) ----- 2 ml ----- 2 ml 5 ml
Blanco ----- 4 ml ----- ----- 5 ml
Extracto I (1:10) 2 ml ----- ----- 2 ml 5 ml
Blanco-extracto I 2 ml 2 ml ----- ----- 5 ml
Extracto II (1:20) 2 ml ----- ----- 2 ml 5 ml
Blanco-extracto II 2 ml 2 ml ----- ----- 5 ml
Extracto III (1:30) 2 ml ----- ----- 2 ml 5 ml
Blanco-extracto III 2 ml 2 ml ----- ----- 5 ml
Extracto IV (1:40) 2 ml ----- ----- 2 ml 5 ml
Blanco-extracto IV 2 ml 2 ml ----- ----- 5 ml
Inhibidor ----- ----- 2 ml 2 ml 5 ml
Añadimos todos los componentes a los tubos de ensayo excepto el BAPA, el cual añadiremos
después de llevar a los tubos a un baño de agua d 37ºC durante 10 minutos. Una vez pasado
ese tiempo, añadimos el BAPA y volvemos a calentar a 37ºC durante 10 minutos. Por último,
sacaremos los tubos, añadiremos a cada tubo 1 ml de ácido acético (AcH) para detener la
reacción enzimática, agitaremos y mediremos su absorbancia con el espectrofotómetro a 410
nm. Primeramente, mediremos un blanco de actividad 0 y posteriormente el resto de tubos.
