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NORMAS GENERALES DE LABORATORIO
Se trabajará en equipos de 2-3 personas, según el número total de alumnos.
Cada equipo es responsable del mantenimiento y limpieza del material de laboratorio que se pone a su disposición.
Al terminar cada práctica, los puestos de trabajo deberán dejarse listos para el siguiente turno, con todo el material de vidrio y los tubos de 15ml LIMPIOS (lavado con agua y jabón y aclarado con agua destilada) y SECOS. Si se ha ensuciado el papel de filtro sobre el que se trabajaba, deberá cambiarse.
Las cubetas con los colorantes, alcoholes y xileno para realizar las tinciones histológicas deberán permanecer ordenadas en la cabina de gases del laboratorio, junto con el resto de material necesario (cubreobjetos y DPX).
Antes de utilizar las pipetas automáticas , se debe comprobar el rango de volumen de esa pipeta y NUNCA SOBREPASARLO. También, se deben elegir las puntas para las pipetas de acuerdo con ese rango de volumen (mirar tabla del guión). Una vez terminadas de utilizar, las pipetas automáticas deberán colocarse siempre en la parte central de la mesa del laboratorio.
Los residuos se depositarán en el punto limpio, cada uno en su contenedor adecuado.
Tras utilizar los microscopios, se dejarán apagados (sin desenchufar), con el objetivo de menor aumento y con la funda puesta.
Tan sólo se utilizarán guantes cuando el profesor lo recomiende.
NORMAS PARA TRABAJAR CON CULTIVOS CELULARES
Para realizar una manipulación estéril de los cultivos celulares, hay que tener las
siguientes precauciones:
Todas las manipulaciones de las células a cultivar se realizarán en la cabina de flujo laminar.
Se usarán guantes, que se frotarán con alcohol al 70%, antes de empezar a trabajar en la cabina de flujo.
Usar Pipetboy o pipetas automáticas para añadir cualquier reactivo.
Mantener los recipientes abiertos el menor tiempo posible.
Todo el material que se utilice, así como las soluciones a emplear, han de ser esterilizados previamente.
Con las puntas desechables de las pipetas no se debe tocar ninguna superficie para evitar contaminaciones.
Todas las botellas de medio y/o cualquier solución deben atemperarse en un baño y secarse cuidadosamente antes de usarlas.
Ante cualquier duda limpiar con alcohol al 70% cualquier material que pueda estar contaminado (si no es reemplazable) o reemplazarlo, si es posible.
Si se descubre un recipiente contaminado no se debe abrir. Si se han de tomar muestras para su análisis conviene hacerlo en ambiente estéril y después limpiar cuidadosamente el área de trabajo y conectar la iluminación ultravioleta (UV).
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12. ENSAYO DE ADHESIÓN.
Preparamos 3 ml de una suspensión celular con una concentración de 2x10 6 cél/ml en RPMI 2% FBS. Añadirla a una placa Petri de plástico e incubar toda la noche a 4ºC, a temperatura ambiente o a 37ºC (según las indicaciones del profesor) , para permitir la adherencia de las células.
13. CITOCENTRIFUGACIONES (CTCs).
Preparamos un tubo con 1 ml de la suspensión celular a una concentración de 0.5x10^6 cél/ml en RPMI/2% FBS. Guardar en hielo.
14. Hacer 2 preparaciones (Control y Muestra) mediante citocentrifugación (para la práctica 3) de la suspensión celular del tubo que contiene 0.5 x10 6 cél/ml: - Poner 100 l de la suspensión celular. - Centrifugar 5 minutos a 300 rpm. - Dejar secar a temperatura ambiente unos segundos. - Fijar con acetona fría 10 minutos. - Rodear las células con Immunopen ©. - Dejar secar hasta el día siguiente.
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NOTA: Debido a la toxicidad de la DAB, serán los profesores los que la manipulen en todo momento.
15. Dejarlo reaccionar 15 minutos a temperatura ambiente en la cámara húmeda. 16. Inactivar la DAB con la solución de KMnO 4 3%/Na 2 CO 3 2% y lavar la preparación con agua en la cubeta de Coplin (2 lavados de 2 minutos cada uno). 17. Para teñir los núcleos de los astrocitos, contrastaremos las preparaciones con Azul de Toluidina durante 2 minutos y lavar con agua, hasta eliminar el exceso. 18. Deshidratar:
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19. Montar con DPX. 20. Una vez montadas las preparaciones, dejar secar para observarlas al microscopio el último día.
Nota importante : Todas las incubaciones se realizan en cámara húmeda. Antes de cada incubación se debe secar bien el portaobjetos alrededor de la zona donde se encuentran las células pero sin tocar éstas. LAS CÉLULAS DEBEN PERMANECER SIEMPRE HÚMEDAS.
