Prácticas de Biología Celular
Biología Celular e Histología
•Cultivos celulares y Procesamiento de tejidos.
•Suspensiones celulares.
•Inmunodetección directa.
•Identificación celular tras cultivo.
•Manejo del microscopio óptico.
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practicas presentacion tres, Ejercicios de Biología Celular
Asignatura: Biología celular e histología (grado), Profesor: Yasmina Juarranz, Carrera: Biología, Universidad: UCM
Tipo: Ejercicios
2014/2015
1 / 17
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Prácticas de Biología Celular
Biología Celular e Histología
-^
Cultivos celulares y Procesamiento de tejidos.
-^
Suspensiones celulares.
-^
Inmunodetección directa.
-^
Identificación celular tras cultivo.
-^
Manejo del microscopio óptico.
RESUMEN DE LAS PRÁCTICAS
Práctica 1
:^ Introducción a los cultivos celulares y al procesamiento de
tejidos. •Tinciones.•Cultivo de una línea celular de astrocitos (para inmunodetectar vimentina).•Preparación de tampón PBS. Práctica 2: Suspensión celular de bazo: disgregación mecánica, separaciónde células adherentes y preparaciones por CTC. •Obtener una suspensión celular de bazo.•Determinar viabilidad mediante Azul Tripán.•Cálculo del porcentaje de adherencia.•Realizar preparaciones por Citocentrifugación (CTC). Práctica 3: Inmunodetección directa. •Inmunodetección directa en las obtenidas en la práctica 2.•Determinar el porcentaje de células adherentes de la práctica 2. Práctica 4: Inmunodetección indirecta. •Inmunodetección diferencial de filamentos intermedios (vimentina) en las célulascrecidas en portaobjetos de la práctica 1.•Contratinción con Azul de Toluidina. Práctica 5: Manejo del microscopio óptico •Observación e interpretación de las preparaciones realizadas.
Métodos de fijación.
Para preservar la antigenicidad es preferible utilizar fijadores de tipo precipitante, yaque los entrecruzantes son mejores para la conservación morfológica.^ ^ Acetona o metanol o etanol 96º. Precipitantes. Fijan permeabilizando membranas.
Células en cultivo o extensiones de muestras citológicas.Cortes en criostato.
^ Formaldehído 3,7% en PBS o Paraformaldehído al 4% en PBS.^ Entrecruzantes. Fijan sin permeabilizar. Laboratorios de Anatomía Patológica. ^ Fijador de Bouin.^ Mezcla de entrecruzante y dos precipitantes. ^ Glutaraldehído. ^ Mezclas de tipo Karnovsky. ^ Tetraóxido de osmio.^ Microscopia electrónica.
Inmunodetección.
La^
inmunodetección
consiste
en
detectar
mediante
el
uso
de
anticuerpos específicos un componente celular.Definir términos:^ Epítopo
o^
determinante
antigénico
:^ región/es
del
Ag
que
es
Antígeno reconocida por los Ac y los receptores de los linfocitos.
: molécula que provoca una respuesta inmunitaria.
Especificidad
: capacidad de los Ac para discriminar entre Ag.
Afinidad
: intensidad de la unión entre el Ac y el Ag.
Reacción cruzada
: interacción inespecífica de un Ac con un Ag
distinto del que debería reconocer. Sensibilidad
: cantidad mínima de Ag que se puede detectar con
una técnica determinada.
Inmunodetección
Tipos de anticuerpos
Anticuerpos Policlonales
Antígenosintetizado Los
anticuerpos policlonales
reconocen varios epítopos de un mismo antígeno
Ventajas: mayor espectro de reactividad, intensidad de señal elevada, másbaratos.Problema: más probabilidad de reacciones cruzadas, producen algo defondo.
Inmunodetección
Los
anticuerpos monoclonales
reconocen un solo epítopo.
Ventaja: gran especificidad, producen menos fondo.Problema: técnica puede alterar ese epítopo y enmascararlo. Son máscaros y la concentración de trabajo suele ser mayor.
Tipos de anticuerpos Anticuerpos monoclonales
Antígeno
Anticuerpo
Detector
Inmunodetección directa
Antígeno
Anticuerpo secundario
Detector Anticuerpo primario
Inmunodetección indirecta
Inmunodetección^ Tipos de inmunodetecciones
Inmunodetección
Tipos de marcadores.Fluorocromos.
Técnicas de inmunofluorescencia.
Inmunodetección
Controles
►^ Interacciones electrostáticas…
►Preincubar la muestra con suero normal a concentración alta(1:30). ►O bloquear uniones inespecíficas con BSA. ►O añadir detergente a soluciones de lavado.
►^ Control positivo: usando cél./tejidos que expresan el Ag a detectar. ►^ Controles negativos:
- Revelado sin pasos previos (presencia endógena de enzima).• No poner anticuerpo primario y poner suero no inmune.• No poner anticuerpo secundario o complejos de revelado.
Detección de subpoblaciones celulares
mediante inmunodetección
Con la inmunodetección directa o indirecta podemos detectar proteínas de superficie ointracelulares en cortes de tejidos, células en cultivo o suspensiones celulares, valorar siexpresan más o menos dependiendo de las condiciones de esas células, estudiar sulocalización celular, etc.Otra utilidad es poder distinguir un tipo celular específico en una suspensión celular convarias
subpoblaciones
celulares,
utilizando
para
ello
marcadores
de
superficie
o
intracelulares específicos de cada subpoblación celular.
En nuestro caso:Tinción Específica
(inmunotinción), para detectar moléculas de IgG en las células del
bazo de ratón.La IgG se expresa en la membrana de un tipo de linfocitos B y es segregada por lascélulas plasmáticas.-^ Inmunorreacción
: se lleva a cabo utilizando un anticuerpo policlonal anti-IgG de ratón,
desarrollado en cabra, que se unirá específicamente a la molécula diana de IgG.-^ Localización de la reacción Ac-IgG
: el Ac elegido NO está marcado con ningún
cromóforo (la reacción no es visible), sino que está conjugado con una enzima(peroxidasa). Al complejo IgG-Ac-Per se añade el sustrato de la enzima (H
O), 22
liberándose O
-^. Éste oxida la DAB añadida, aportando color marrón a la reacción, lo que
permite localizar las moléculas de IgG.
DAB
PeroxidasaAc anti-IgGIgG DAB:
Diaminobencidina
H^ O^2
Linf. B
DAB
H^ O +^2