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NORMAS GENERALES DE LABORATORIO
Se trabajará en equipos de 2-3 personas, según el número total de alumnos.
Cada equipo es responsable del mantenimiento y limpieza del material de laboratorio que se pone a su disposición.
Al terminar cada práctica, los puestos de trabajo deberán dejarse listos para el siguiente turno; es decir, con todo el material LIMPIO (lavado con agua y jabón y aclarado con agua destilada) y SECO. Si se ha ensuciado el papel de filtro sobre el que se trabajaba, deberá cambiarse.
Las cubetas con los colorantes para realizar las tinciones histológicas deberán permanecer ordenadas en la zona correspondiente del laboratorio, junto con el resto de material necesario (cubreobjetos y DPX).
Antes de utilizar las pipetas automáticas , se debe comprobar el rango de volumen de esa pipeta y NUNCA SOBREPASARLO. También, se deben elegir las puntas para las pipetas de acuerdo con ese rango de volumen (mirar tabla del guión). Una vez terminadas de utilizar, las pipetas automáticas deberán colocarse siempre en la parte central de la mesa del laboratorio.
Los residuos se depositarán en el punto limpio, cada uno en el contenedor adecuado.
Tras utilizar los microscopios, se dejarán apagados (sin desenchufar), con el objetivo de menor aumento y con la funda puesta.
Tan sólo se utilizarán guantes cuando el profesor lo recomiende.
NORMAS PARA TRABAJAR CON CULTIVOS CELULARES
Para realizar una manipulación estéril de los cultivos celulares, hay que tener las
siguientes precauciones:
Todas las manipulaciones de las células a cultivar se realizarán en la cabina de flujo laminar.
Se usarán guantes, que se frotarán con alcohol 70%, antes de empezar a trabajar en la cabina de flujo.
Usar Pipetboy o pipetas automáticas para añadir cualquier reactivo.
Mantener los recipientes abiertos el menor tiempo posible.
Todo el material que se utilice, así como las soluciones a emplear, han de ser esterilizados previamente.
Con las puntas desechables de las pipetas no se debe tocar ninguna superficie para evitar contaminaciones.
Todas las botellas de medio y/o cualquier solución deben atemperarse en un baño y secarse cuidadosamente antes de usarlas.
Ante cualquier duda limpiar con alcohol 70 % cualquier material que pueda estar contaminado (si no es reemplazable) o reemplazarlo, si es posible.
Si se descubre un recipiente contaminado no se debe abrir. Si se han de tomar muestras para su análisis conviene hacerlo en ambiente estéril y después limpiar cuidadosamente el área de trabajo y conectar la iluminación ultravioleta (UV).
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PRÁCTICA 1
Introducción a los cultivos celulares. Introducción a las técnicas de procesamiento y tinción de tejidos. Preparación de reactivos.
Esta práctica se dividirá en cuatro partes:
- Tinción de Hematoxilina-Eosina sobre un corte de tejido de mamífero.
- Tinción tricrómica: Azul Alcián-Hemalumbre-Picrocarmín de Índigo.
- Descongelar una línea celular y sembrarla para ser usada en la práctica 4.
- Preparar PBS 10x.
1ª Parte: TINCIÓN DE HEMATOXILINA-EOSINA.
Los cortes fijados e incluidos en parafina serán proporcionados por el profesor y estarán ya desparafinados e hidratados.
1. Teñir la preparación con Hematoxilina de Carazzi (se da ya preparada según las siguientes concentraciones en H 2 O destilada: 0.1% hematoxilina/20% glicerina/ 5% alumbre potásico/0.02% yodato potásico) durante 10 minutos. 2. Lavar bajo el flujo de agua corriente hasta “azulear” (unos 5 min). 3. Teñir la preparación con Eosina (Se da ya preparada según las siguientes concentraciones en H 2 O destilada: 1.25% eosina) durante 2 minutos. 4. Lavar con agua corriente varias veces hasta que el agua quede limpia. 5. Diferenciar y deshidratar:
10 s – 20 s Etanol 96 %. 1 min – Etanol 100% (dos veces). 1 min – Xileno (dos veces).
6. Montar con DPX. 7. Una vez montadas las preparaciones, dejar secar para observarlas al microscopio el último día.
2ª Parte: TINCIÓN TRICRÓMICA: AZUL ALCIÁN- HEMALUMBRE- PICROCARMÍN DE ÍNDIGO.
Los cortes fijados e incluidos en parafina serán proporcionados por el profesor y estarán ya desparafinados e hidratados.
1. Teñir la preparación durante 10 min. con Azul Alcián (se da ya preparado según las siguientes concentraciones en H 2 O destilada: 1% azul alcián/3% ácido acético). 2. Lavar bajo el flujo de agua corriente hasta eliminar el exceso de colorante. 3. Teñir durante 8 min. la preparación con Hemalumbre (se da ya preparado según las siguientes concentraciones en H 2 O destilada: 0,2% hemateína/5% alumbre potásico/2% ácido acético). 4. Lavar en agua corriente (unos 5 min). 5. Teñir 1 min. la preparación con Picrocarmín de Índigo (se da ya preparado según las siguiente concentración: 3.5 g de carmín de índigo y 1000 ml de ácido pícrico saturado). 6. Lavar en agua corriente hasta eliminar el exceso de colorante. 7. Deshidratar: a. Etanol 100 % – 2 min (dos veces). b. Xileno – 1 min (tres veces). 8. Montar con DPX. 9. Una vez montadas las preparaciones, dejar secar para observarlas al microscopio el último día.
PRÁCTICA 2
Suspensión celular de bazo: disgregación mecánica y separación celular de células adherentes.
1. Dividir los bazos en tres partes y repartir un fragmento por grupo. 2. Cada grupo humedecerá la malla con una gota de RPMI, situada sobre la placa Petri de cristal, y disgregará el tejido con un émbolo de jeringa. 3. Cuando el bazo quede reducido a una masa de fibras de color blanco, añadiremos RPMI al 2% de FBS (máximo 2 ml) con la pipeta Pasteur para recoger las células. 4. Una vez disgregado el órgano, retirar la malla con los restos. Homogeneizar la suspensión con la jeringuilla (sin aguja), subiendo y bajando el émbolo varias veces (CON CUIDADO) hasta asegurarnos de que se han deshecho los grumos. 5. Desde este punto se trabajará poniendo la suspensión en hielo. Recoger la suspensión celular con una pipeta Pasteur y filtrarla a través de otra pipeta Pasteur larga que contiene algodón ( previamente humedecido con 2 ml de RPMI al 2% FBS), recogiéndola en un Falcon de 15 ml graduado. 6. Una vez filtrada, añadir 1 ml más de RPMI al 2% FBS al algodón para recuperar el mayor número de células posible. 7. Centrifugar durante 5 minutos a 1800 rpm. 8. Resuspender en 1 ml de tampón de lisis (160mM NH 4 Cl + 5.7mM K 2 HPO 4 + 0.1mM EDTA, diluido en H 2 0 y con pH 7.3), para eliminar los eritrocitos existentes. Mantener el tubo en hielo 10 minutos. 9. Añadir 4 ml de RPMI 2% FBS para detener la lisis de las células y centrifugar durante 5 minutos a 1800 rpm. 10. Antes de resuspender el pellet, cada grupo deberá preguntar al profesor cuántos ml de RPMI al 2% FBS son necesarios para su pellet. 11. Contar el número de células/ml, determinando también la viabilidad celular. Para ello, se ponen 100 l de suspensión celular más 100l de azul tripán en un Eppendorf y se cuentan las células en el hemocitómetro o cámara de Neubauer , calculando la concentración celular y el índice de viabilidad.
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Continuamos con los ensayos de la práctica 2:
12. ENSAYO DE ADHESIÓN.
Preparamos 3 ml de una suspensión celular con una concentración de 2x10 6 cél/ml en RPMI 2% FBS. Añadirla a una placa Petri de plástico e incubar toda la noche a 4ºC, a temperatura ambiente o a 37ºC (según las indicaciones del profesor) , para permitir la adherencia de las células.
13. CITOCENTRIFUGACIONES (CTCs).
Preparamos un tubo con 1 ml de la suspensión celular a una concentración de 0.5x10^6 cél/ml en RPMI/2% FBS. Guardar en hielo.
14. Hacer 2 preparaciones (Control y Muestra) mediante CTC (para la práctica 3) de la suspensión celular del tubo que contiene 0.5 x10^6 /ml: - Poner 100 l de la suspensión celular. - Centrifugar 5 minutos a 300 rpm. - Dejar secar a temperatura ambiente unos segundos. - Fijar con acetona fría 10 minutos. - Rodear las células con Immunopen ©. - Dejar secar hasta el día siguiente.
PRÁCTICA 3
Inmunodetección directa en linfocitos B de la suspensión celular obtenida en la práctica 2.
Se usarán las dos CTC preparadas en la práctica 2. Una de ellas se usará para realizar la inmunodetección directa (muestra) y la otra será un control de anticuerpo.
Nota importante : todas las incubaciones se realizarán en cámara húmeda. Antes de cada incubación, secar bien el portaobjetos en la zona opuesta a donde se encuentran las células. Las células deberán permanecer siempre húmedas.
1. Rehidratar las preparaciones con PBS, introduciéndolas en la cubeta de tinción situada en el centro de la mesa del laboratorio. 2. Inhibir la peroxidasa endógena: poner ambos portaobjetos en una cubeta de Coplin durante 15 minutos con la siguiente disolución de PBS al 2% de H 2 O 2 : - 49 ml PBS - 1 ml H 2 O 2 3. Lavar con PBS durante 3 minutos en la cubeta de tinción.
A partir de este punto sólo se trabaja con un portaobjetos (muestra). El otro portaobjetos , preparación control (al que no vamos a añadir el anticuerpo), se deja en la cubeta con PBS.
4. Incubar con el anticuerpo primario (anti-IgG de ratón desarrollado en cabra y conjugado con HRP) diluido 1/250 en PBS, con suero de cabra al 1%. Añadir 100 μl de la dilución del anticuerpo dentro de la zona del portaobjetos delimitada con el Immunopen ©. El suero de cabra al 1% se añade para evitar uniones inespecíficas. 5. Dejar incubando 45 minutos a temperatura ambiente en la cámara húmeda. 6. Descartar la gota de anticuerpo de la preparación en el vaso de residuos. 7. Realizar 3 lavados de 5 minutos cada uno con PBS. 8. Sistema de revelado: la actividad peroxidasa se revela utilizando diaminobencidina (DAB) como sustrato. Para ello, el profesor preparará la solución de revelado, siguiendo las instrucciones de la casa comercial.
A partir de este punto se emplean los dos portaobjetos, incluido el que será utilizado como “control de anticuerpo”.
PRÁCTICA 4
Identificación de astrocitos por inmunodetección indirecta de vimentina (un tipo de filamento intermedio).
1. Sacar el portaobjetos del medio de cultivo con unas pinzas, escurrir en un papel de filtro. 2. Fijación de las células: fijar con una solución de formaldehído al 4% en tampón PBS 0.1M, durante 5 minutos. (Usar guantes) 3. Lavar con PBS, 2 cambios de 2 minutos cada uno. 4. Inhibir la peroxidasa endógena: poner en cubeta de tinción durante 10 minutos con la disolución: 49 ml de PBS + 1 ml. de H 2 O 2. 5. Lavar con PBS, 2 cambios de 2 minutos cada uno. 6. Escurrir bien el porta y secar con papel absorbente, respetando una zona circular de 1 a 2 cm de diámetro, que es en la que se realizará la inmunodetección. Hacer un círculo con el Immunopen © alrededor de la zona elegida. 7. Incubar con el anticuerpo primario (monoclonal, anti-vimentina de rata desarrollado en ratón) diluido 1/500 en PGT (PBS con 0.3% de gelatina y 0.3% de Tritón X100; la gelatina bloquea posibles uniones inespecíficas y el detergente tritón permeabiliza la membrana plasmática, facilitando la entrada del anticuerpo). Poner 100 μl de la dilución del anticuerpo dentro de la zona del portaobjetos delimitada con el Immunopen ©. 8. Incubar durante 45 minutos a temperatura ambiente y en cámara húmeda. 9. Escurrir el anticuerpo primario en el vaso de residuos y lavar dos veces, durante 3 minutos cada vez, en PBS. 10. Incubar con el anticuerpo secundario (anti IgG de ratón desarrollado en cabra y conjugado con HRP) en la dilución 1/250 en PGT. Añadir 100 μl de la dilución del anticuerpo dentro de la zona del portaobjetos delimitada con el Immunopen ©. 11. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente, en cámara húmeda. 12. Escurrir y lavar con PBS, 2 cambios de 3 minutos cada uno. 13. Sistema de revelado: la actividad peroxidasa se revela utilizando diaminobencidina (DAB) como sustrato. Para ello, el profesor preparará la solución de revelado, siguiendo las instrucciones de la casa comercial.
14. Añadir 100 μl de la solución de revelado dentro de la zona del portaobjetos delimitada con el Immunopen ©
NOTA: Debido a la toxicidad de la DAB, serán los profesores los que la manipulen en todo momento.
15. Dejarlo reaccionar 15 minutos a temperatura ambiente en la cámara húmeda. 16. Inactivar la DAB con la solución de KMnO 4 3%/Na 2 CO 3 2% y lavar la preparación con agua en la cubeta de Coplin (2 lavados de 2 minutos cada uno). 17. Para teñir los núcleos de los astrocitos, contrastaremos las preparaciones con Azul de Toluidina durante 2 minutos y lavar con agua, hasta eliminar el exceso. 18. Deshidratar:
30 s – Etanol 96 % 30 s – Etanol 100% (2 veces). 1 min. – Xileno (2 veces).
19. Montar con DPX. 20. Una vez montadas las preparaciones, dejar secar para observarlas al microscopio el último día.
Nota importante : Todas las incubaciones se realizan en cámara húmeda. Antes de cada incubación secar bien el portaobjetos alrededor de la zona donde se encuentran las células pero no éstas. LAS CÉLULAS DEBEN PERMANECER SIEMPRE HÚMEDAS.
