¡Descarga Pràctiques integrades. secció 2 y más Ejercicios en PDF de Biología solo en Docsity!
CAPACITAT DE PSEUDOMONAS PUTIDA F1 EN BIODEGRADAR
COMPOSTOS AROMÀTICS MITJANÇANT DIFERENTS BIOREACTORS
Andreu Albó, Júlia Batlle, Estel Viñolas En aquest estudi s’han realitzat experiments mitjançant diferents bioreactors per tal d’estudiar la capacitat de Pseudomonas Putida F1 en la biodegradació de compostos aromàtics. El bioreactor Batch s’ha utilitzat per determinar els paràmetres cinètics i estequiomètrics de la velocitat màxima de creixement (μmax), la constant de semisaturació de fenol (Ks) i el rendiment cel·lular (Yxs). El reactor en discontinu Fed-Batch ha permès estudiar la capacitat de biodegradació del fenol de Pseudomonas Putida F1 en unes condicions on s’addiciona substrat concentrat i així controlar les velocitats de reacció i les reaccions metabòliques de dins el reactor. Seguidament, amb el quimiòstat s’ha determinat el comportament del microorganisme comentat anteriorment en unes condicions on el creixement bacterià està en fase exponencial amb una elevada activitat metabòlica. Finalment, mitjançant també el quimiòstat s’ha estudiat la capacitat de biodegradació simultània de compostos aromàtics (fenol i triclorofenol, TCP). Metodologia En el bioreactor Batch es va addicionar un volum de solució mare P. Putida F1 de 250mL, 500mL de solució mineral i una solució amb 70mL de fenol i 430mL de solució mineral per tal d’obtenir una concentració de 50ppm. Es van agafar mostres cada 15 minuts durant la primera hora i cada 30 minuts fins a un temps total de 3 hores. El bioreactor Fed-Batch es va treballar amb un volum inicial de P. Putida F1 de 250mL i es va alimentar mitjançant una bomba peristàltica un cabal constant de 4mL/min d’una solució de 50ppm de fenol. De nou, es van agafar mostres cada 15 minuts durant la primera hora i cada 30 minuts fins a un temps total de 2 hores. El bioreactor quimiòstat contenia una solució inicial de 250mL de P. Putida F1 i 500mL de solució mineral. A més, es va preparar una solució de fenol 50ppm a partir de la qual mitjançant una bomba peristàltica s’introduïa un cabal de 4mL/min a dins el tanc. El cabal de sortida també era de 4mL/min per tant el volum es va mantenir constant durant tot el procés. Igual que en els dos bioreactors anteriors, es van agafar mostres cada 15 minuts durant la primera hora i cada 30 minuts fins a un temps total de 3 hores. Finalment, es va realitzar un altre quimiòstat amb un volum inicial de P. Putida F1 de 250mL i 1L de solució mineral amb 20ppm de fenol. També es va preparar una solució de 50ppm de fenol a partir de la qual, mitjançant una bomba peristàltica, s’alimentava el reactor amb un cabal constant de 1mL/min. Es van recollir mostres cada 30 minuts fins a un temps total d’estudi de 3 hores, però en el minut 120 es va introduir 62mL de triclorofenol (TCP) amb una concentració de 25mg/L. En tots els experiments, utilitzant diferents bioreactors, es va treballar amb constant agitació per tenir un medi homogeni i aeració. La temperatura de reacció, constant durant les reaccions, va ser de 30ºC. Per tal de determinar la concentració de biomassa i de fenol de les diferents mostres es va mesurar la densitat òptica a 550nm i 269nm, respectivament. En tots
els experiments també es va mesurar la concentració de fenol inicial de la solució mare de Pseudomonas Putida F. Estudi dels paràmetres estequiomètrics i cinètics en la biodegradació de fenol Pel càlcul dels paràmetres cinètics i estequiomètrics de P.Putida F1 i sabent que el microorganisme segueix una cinètica de Monod s’ha linealitzat la següent equació (Eq.1) i mitjançant valors experimentals de les concentracions de substrat i les velocitats de creixement del microorganisme s’han obtingut els paràmetres de velocitat màxima de creixement (μmax) i constant de semisaturació del fenol (Ks). El rendiment (Yxs) obtingut és la mitjana de diferents valors experimentals calculats a partir de la representació gràfica de l’evolució del substrat i la biomassa respecte el temps. Aquests càlculs es troben a l’informe preliminar de la secció 2. μ = μmax + S Ks + S Equació 1 1 μ
Ks μmax
S
μmax Equació 1 linealitzada La reacció del reactor en Batch amb el microorganisme P.Putida F1 ha permès determinar els següents paràmetres ( Taula 1) Taula 1. Paràmetres cinètics i estequiomètrics en la biodegradació del fenol amb un cultiu enriquit amb P.Putida F1. S’ha determinat la velocitat màxima de creixement (μmax), la constant de semisaturació de fenol (Ks) i el rendiment cel·lular (Yxs) i es comparen amb els valors teòrics (Kenneth F. Et al, 2000) μmax (h-^1 ) Ks (mg/L) Yxs (g/g) Valors experimentals 0.38 10.62 0.474 ± 0. Valors teòrics 0.11 ± 0.01 32.0 ± 2.4 0.80 ± 0. Com es pot observar a la taula 1 el valor experimental de μmax (0.388 h-^1 ) es desvia del valor teòric del microorganisme (0.11 h-^1 ); la constant de semi-saturació experimental (10.62 mg/L) també varia significativament respecte la teòrica (32mg/L); el rendiment experimental obtingut és, aproximadament, la meitat del rendiment teòric de P.Putida F1 (0.474g/g). El valor inferior de la constant de semisaturació indica que el microorganisme té menys afinitat en la degradació del fenol; de la mateixa manera, el consum de biomassa per unitat de substrat és la meitat, per tant la reacció és més lenta. Les discrepàncies entre aquests valors poden ser a causa d’errors experimentals com una contaminació externa, error en la mesura d’absorbàncies...
Gràfic 2. Evolució teòrica de la concentració de biomassa (mg/L) i fenol (mg/L) d’un bioreactor fed-batch durant 24h amb P.Putida F1. Simulació amb el programa Stella. La finalitat de treballar amb un bioreactor fed-batch és obtenir elevades concentracions cel·lulars per obtenir gran quantitat de biomassa. Inicialment, fins a t=3h el substrat no es consumeix i per tant s’acumula, mentre que la biomassa disminueix lleugerament perquè al addicionar un cabal de 4mL/min el volum del reactor augmenta i per tant la dilució disminueix. Això és causat perquè el volum augmenta al addicionar un cabal constant de 4mL/min, és a dir, la concentració de biomassa disminueix perquè està més diluïda en el reactor. La biomassa més diluïda no pot degradar tot el fenol que entra pel cabal i s’acumula. A partir de les 3h el microorganisme ja s’ha adaptat a aquestes condicions i comença a degradar el fenol ( Gràfic 2 ) per tant disminueix la seva concentració a l’interior del reactor. La concentració teòrica de fenol i biomassa obtingudes amb la simulació Stella transcorregudes les 24h són 1.25mg/L i 18.72mg/L respectivament. Per altra banda, amb els valors experimentals obtinguts i les constants cinètiques P.Putida F1 ( taula 1 ) el fenol presenta una concentració de 1.18mg/L i la biomassa de 27.45mg/L. Els balanços introduïts en el programa Stella per fer les simulacions són els següents: dx dt
= X · (−D + μ)^
dS dt
= D · (Se − S)^ −
μ Yxs
· X
dV dt = F S’introdueixen els valors de biomassa i substrats següents: So = 4.23 mg/L Se = 50.81 mg/L Xo = 27.28 mg/L F = 4mL/min V = 0.25mL 0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Fenol (mg/L) Temps (hores) Fenol Biomassa Biomassa (^) (mg/L)
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 2 4 6 8 10 12 Fenol (mg/L ) Temps (hores ) Fenol Biomassa 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25 0 0,5 1 1,5 2 Biomassa (mg/L) Temps (hores) [Fenol] teòric [Fenol] [Biomassa] teòric [Biomassa] Biodegradació de fenol en un quimiòstat amb un cultiu enriquit de Pseudomonas putida F A continuació es mostren els resultats obtinguts experimentalment i amb els valors obtinguts amb la simulació de Stella en la degradació del fenol com a font de carboni en un quimiòstat. Gràfic 3. Evolució de la concentració de biomassa (mg/L) i fenol (mg/L) teòrica i experimental en un reactor quimiòstat amb un cultiu de P.Putida F1 en un període de reacció de 2 hores. L’evolució de la concentració de fenol experimental augmenta al llarg del temps mentre que la de biomassa disminueix lleugerament. Aquests valors presenten la mateixa tendència que els valors teòrics obtinguts a partir del programa Stella ( gràfic 3 ) En la simulació de l’evolució de la concentració de fenol s’observa que els valors augmenten fins a una concentració de 27mg/L aproximadament mentre que els valors experimentals d’aquest compost augmenten fins a 14mg/L. Per altra banda, com s’ha comentat anteriorment, la concentració de biomassa tendeix a disminuir lleugerament, però els valors són molt constants. Les dades teòriques del programa Stella indiquen una disminució fins a una concentració final a t=2h de 3,5mg/L, valor que coincideix amb la dada experimental. Gràfic 4. Evolució teòrica de la concentració de biomassa (mg/L) i fenol (mg/L) d’un quimiòstat durant 12h amb P.Putida F1. Simulació amb el programa Stella. Fenol (mg/L)
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Fenol (mg/L) Temps (hores) Fenol Biomassa Gràfic 5. Evolució teòrica de la concentració de fenol (mg/L) i biomassa (mg/L) d’un quimiòstat treballant a D òptima (0.22 h-^1 ) de P.Putida F1. Simulació amb el programa Stella Per tal de millorar l’eficiència i obtenir la màxima producció de biomassa degradant el fenol s’hauria de treballar a la D òptima (0.22 h-^1 ), valor en el qual la productivitat és màxima i per tant es degrada la màxima quantitat de fenol ( gràfic 5 ) El cabal d’aquesta dilució té un valor de 0.165mL/min. Com es pot veure al gràfic 5 , la biomassa no disminueix ja que no s’elimina del tanc, no es produeix rentat. A més, el fenol inicialment augmenta perquè s’acumula, el microorganisme no el pot degradar tot, però a partir de t=10h aproximadament la concentració d’aquest compost disminueix fins a arribar a l’estat estacionari. El cabal màxim al qual es podria operar és de 0.239mL/min ja que és el que correspon a la dilució crítica. Una altra opció seria treballar amb una concentració de substrat més elevada i un cabal més petit, però el temps de reacció seria molt llarg i concentracions de fenol excessivament elevades podrien produir toxicitat al microorganisme. Valors de dilució superiors a la Dcrítica no són viables perquè es produeix el rentat del microorganisme però si s’opera amb un quimiòstat amb biomassa immobilitzada o amb un filtre a al sortida del tanc que permeti la re-circulació de cèl·lules sí és factible. Biomassa (^) (mg/L)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 0,5 1 1,5 2 Biomassa (mg/L) Temps (hores) [Fenol] Act. 3 [Biomassa] Act. [Biomassa] Act. 4 [Fenol] Act. 4 Biodegradació de compostos aromàtics (fenol i triclorofenol) en un quimiòstat Gràfic 6. Resultats experimentals de fenol (mg/L) i biomassa (mg/L) en quimiòstat amb dos tractaments diferents. Activitat 3: Degradació del fenol; Activitat 4: Degradació simultània de fenol i TCP. Creixement de P.Putida F1 biodegradant diferents compostos aromàtics amb un temps de reacció de 2hores. El gràfic 6 presenta el creixement del microorganisme P.Putida F1 en un període de 2 hores. En els dos experiments es va treballar amb un quimiòstat però en l’activitat 3 es va estudiar la degradació del fenol mentre que en l’activitat 4 es va estudiar el comportament del cultiu P. Putida F1 en la degradació simultània de dos compostos aromàtics (fenol i triclorofenol) amb un cabal 4 vegades inferior que en l’altre experiment. En l’activitat 3, la qual s’ha comentat anteriorment, el P.Putida F1 té la capacitat de degradar el fenol sempre i quan es treballi a una dilució inferior a la crítica (gràfic 5). Els valors de fenol augmenten mentre que els de biomassa disminueixen lleugerament perquè es va produir rentat del microorganisme. La concentració de fenol en l’activitat 4 també augmenta, però no assoleix els mateixos valors que en l’altre experiment. Fins a t=1h els valors augmenten lleugerament, es mantenen bastant constants, per tant el microorganisme té la capacitat de degradar-lo. A partir de t=1h, s’addiciona al reactor 62mL de triclorofenol (TCP), i s’observa un augment considerable de la concentració de fenol ja que l’espectrofotòmetre no només detecta el fenol, sinó també el TCP. Tot i això, de seguida torna a estabilitzar-se. Respecte la concentració de biomassa, es manté constant tot el procés, no es produeix rentat. Fenol (mg/L)
Fenol (mg/L) Temps (minuts ) [Fenol] Secció 2 [Fenol] Secció 3 [Catecol]Secció 3 Per altra banda, com s’ha comentat anteriorment, la concentració de biomassa és molt constant i semblant a la teòrica. Les dades de Stella presenten un valor de 5mg/L mentre que les experimentals un valor de 2mg/L aproximadament. Com s’ha comentat anteriorment, no es produeix rentat del microorganisme ja que aquest no s’elimina del reactor gràcies a la disminució del cabal. Els balanços introduïts en el programa Stella per fer les simulacions són els següents: dx dt
= X · (−D + μ)^
dS dt
= D · (Se − S)^ −
μ Yxs
· X
S’introdueixen els valors de biomassa i substrats següents: So = 0.16 mg/L Se = 54.66 mg/L Xo = 2.35 mg/L F = 1mL/min V = 1250mL fins el minut 120, després s’afegeix 64mL de TCP. Tot seguit es comparen els diferents valors de compostos aromàtics trobats respecte els de la secció 3 mitjançant tècniques cromatogràfiques. Gràfic 8. Valors experimentals de Fenol i Catecol mitjançant tècniques cromatogràfiques i concentracions de fenol mitjançant mesura d’absorbància a 550nm del microorganisme P.Putida F1 en un quimiòstat. La secció 2 correspon a les dades d’absorbància mentre que la secció 3 a la cromatografia de líquids. Com es pot veure al gràfic 8 les concentracions de fenol calculades a partir d’absorbància respecte les calculades a partir dels resultats d’una cromatografia de líquids (HPLC) varien lleugerament tot i ser de la mateixa mostra. La tendència d’aquest compost en els resultats de la secció 3 és augmentar progressivament, mentre que els de la secció 2, tot i que també augmenten al principi, a partir de t=120minuts presenta una lleugera disminució. Catecol (^) (mg/L)
Respecte el catecol, no hi és present en cap de les mostres. No s’ha pogut conèixer amb certesa les causes de l’absència d’aquest element i s’haurien de realitzar experiments posteriors per saber-ho. Una possible causa podria ser que dos degradat molt ràpid o que fos retingut a l’interior de la cèl·lula. Els processos de tractament biològic de la matèria orgànica es basa en la utilització d’aquesta com a font de carboni. La biodegradació dels compostos fenòlics ha demostrat que existeix una ruta metabòlica comuna per aquests tipus de compostos (Garcia A, 2007). En l’etapa inicial es consumeix l’oxigen i per acció de l’enzim fenol monooxigenasa s’addiciona un grup OH-^ a l’anell fenòlic, donant com a resultat el catecol. Aquest anell pot ser trencat per diferents rutes de biodegradació, la ruta orto i la ruta meta les quals inclouen vàries reaccions mitjançant diferents enzims per obtenir un producte final de diòxid de carboni i aigua, compostos que són introduïts al cicle de Krebs. En el cas particular de P.Putida F1 el catecol es degrada a través de la via meta i, c om s’ha comentat anteriorment, al ser un intermediari en la degradació del fenol, té la capacitat d’inhibir el consum de substrat si aquest s’acumulés. Per tal de reduir la concentració de fenol fins a un valor màxim de 1mg/L alimentant amb 50mg/L és millor treballar amb un reactor Fed-Batch el qual permet obtenir una elevada concentració cel·lular en el bioreactor i per tant tenir més microorganismes que puguin degradar el fenol. Tal com s’observa el gràfic 2 P.Putida F1 disminueix fins a valors pròxims a 0mg/L la concentració de fenol dins el bioreactor en un període de 24 hores. A més, amb aquest tipus de bioreactor hi ha un excel·lent control i optimització del procés. El quimiòstat permet obtenir elevades concentracions de producte, s’utilitza per la producció, per exemple, d’antibiòtics però és més fàcil que es contamini o que presenti mutacions espontànies del microorganisme que alterin el procés de reacció. A més, com que tenim un cabal de sortida la biomassa de l’interior disminueix i per tant la concentració de substrat augmenta, fet que comporta al rentat del microorganisme i s’aturi la reacció. Altres microorganismes capaços de degradar el fenol i el triclorofenol són altres soques de pseudomones, Agrobacterium, Azotobacter. També Achromobacter marplatensis, Cuprivadius necator (Xun, L et al 2012) Conclusions Els paràmetres cinètics i estequiomètrics experimentals de P.Putida F1 varien lleugerament respecte els valors teòrics per errors experimentals. A més, el microorganisme P.Putida F presenta la capacitat de degradar el fenol en els diferents bireactors, tot i que segons les característiques de l’operació el procés pot ser més eficient. En el reactor Fed-Batch la concentració de fenol augmenta inicialment però transcorregudes 24hores es degrada. El microorganisme P.Putida F1 en el quimiòstat també degrada el fenol com a substrat per obtenir font de carboni tot i que menys eficientment que en el Fed-Batch. Per tal d’evitar el rentat és recomanable treballar amb cabals volumètrics petits, com per exemple 1mL/min. A més, l’addició de TCP a concentracions petites de fenol no es degrada.
Gràfic 7. Resultats experimentals i teòrics de fenol (mg/L) i biomassa (mg/L) en quimiòstat amb la degradació simultània de fenol i TCP. Creixement de P.Putida F1 biodegradant diferents compostos aromàtics amb un temps de reacció de 2 hores. Simulació amb el programa Stella. Gràfic 8. Valors experimentals de Fenol i Catecol mitjançant tècniques cromatogràfiques i concentracions de fenol mitjançant mesura d’absorbància a 550nm del microorganisme P.Putida F1 en un quimiòstat. La secció 2 correspon a les dades d’absorbància mentre que la secció 3 a la cromatografia de líquids. Gràfic 8. Valors experimentals de Fenol i Catecol mitjançant tècniques cromatogràfiques i concentracions de fenol mitjançant mesura d’absorbància a 550nm del microorganisme P.Putida F1 en un quimiòstat. La secció 2 correspon a les dades d’absorbància mentre que la secció 3 a la cromatografia de líquids.
