Prácticas de Biología Celular
Biología Celular e Histología
•Cultivos celulares y Procesamiento de tejidos.
•Suspensiones celulares.
•Inmunodetección directa.
•Identificación celular tras cultivo.
•Manejo del microscopio óptico.
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Guía de Prácticas de Biología Celular: Cultivos y Técnicas de Laboratorio - Prof. Juarranz, Apuntes de Biología Celular
Documento que detalla las prácticas prácticas de biología celular, desde la obtención de cultivos celulares hasta la manipulación de técnicas de laboratorio como el uso de pipetas automáticas, el procesamiento de tejidos y la fijación de muestras. Además, se incluyen normas generales y específicas de laboratorio, así como el uso de medios de cultivo y condiciones de esterilidad.
Tipo: Apuntes
2014/2015
1 / 29
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Prácticas de Biología Celular
Biología Celular e Histología
-^
Cultivos celulares y Procesamiento de tejidos.
-^
Suspensiones celulares.
-^
Inmunodetección directa.
-^
Identificación celular tras cultivo.
-^
Manejo del microscopio óptico.
NORMAS GENERALES DE LABORATORIO
^
Se trabajará en equipos de
2-3 personas
^
Cada alumno es responsable del
mantenimiento
y
limpieza
del material de
laboratorio que se pone a su disposición. ^
Al terminar cada práctica los puestos de trabajo deberán dejarse con todo el material
LIMPIO
(lavado con jabón y aclarado con agua destilada) y
SECO
. El
papel de filtro sobre el que se trabaja deberá cambiarse. ^
Antes de utilizar las
pipetas automáticas
, comprobar bien el
rango de
volumen
que se puede coger con esa pipeta y
NUNCA SOBREPASARLO
También se deben elegir las puntas para las pipetas de acuerdo con eserango de volumen (mirar tabla del guión). ^
Cuando se utilicen
microscopios
, se dejarán
apagados
, sin desenchufar y
con la
funda puesta
^
Las
gradillas
con
los
colorantes
y^
alcoholes,
deberán
permanecer
ordenadas en la mesa correspondiente. ^
Los frascos que contienen el medio de montaje y las cajas de “cubreobjetos” quedarán tapados y en la parte central de las mesas.
GESTIÓN DE RESIDUOS
Para un mejor funcionamiento de los laboratorios, se debe depositar en elrecipiente adecuado todos los residuos generados. En las distintas partes delguión se irán describiendo los procedimientos específicos a seguir en cadacaso:•^ Plástico y vidrio con restos biológicos
: se tira al contenedor específico.
-^ Restos
de
medios
de
cultivo
:^
inactivarlos
con
lejía
y^
posteriormente
desechar.•^ Restos de PBS y tampón de lisis
:^ desecharlos.
-^ Acetona
: recuperarla en la misma botella
-^ Azul de Toluidina
: Recuperarlo en la misma botella, filtrándolo con un
embudo pequeño y un filtro de papel.•Una vez usada la
DAB, el papel, el plástico y los guantes
se tirarán al
contenedor indicado para ello,
“ residuos DAB sólidos
- Los líquidos contaminados con DAB se recogen en la botella “
residuos
líquidos con DAB
” , inactivándose con KMnO4 3% + Na2CO3 2% + H2O
destilada, en la misma proporción que el volumen de DAB desechado.•^ Basura general
: los guantes de látex
y todo lo que no tenga un recipiente
específico, irá en este cubo.
UTILIZACIÓN DE PIPETAS AUTOMÁTICAS
Pipetas automáticas:
Pueden ser de volumen fijo o graduable. La parte
superior del émbolo tiene tres posiciones. Para coger un volumen exacto, sedebe apretar el émbolo hasta la posición intermedia y soltar lentamente. Paradescargar,
se
presiona
hasta
la
posición
intermedia.
Para
descartar
el
volumen restante se puede apretar hasta el final, pero el volumen liberado yano será el exacto. Las puntas son desechables, se tiran apretando el botónpequeño situado en el lateral de la pipeta. Son las más usadas ya quepermiten trabajar con volúmenes exactos y evitan posibles contaminaciones.
Pipeta
Rango demedida
Tipo depuntas
Peque
ña
μ
l^
Blancas
Peque
ña
μ
l^
Amarillas
Intemedia
μ
l^
Amarillas
Grande
μ
l^
Azules
CULTIVOS CELULARES
Experimentación con células en
condiciones absolutamente controladas
Permite:
- Analizar interacciones entre varios tipos celulares.- Estudiar los efectos de adición o eliminación de moléculas.- Manipulaciones genéticas, etc.
Soporte de los cultivos - Vidrio.- Plástico desechable.
Medios de cultivo: - Solución tamponada isotónica rica en sales yelectrolitos.Base:- Azúcares (glucosa).- Aminoácidos.- Sales minerales- Vitaminas.Suplementos:- Rojo fenol (indicador de pH).- Antibióticos.- Suero fetal de ternera (diversos factores decrecimiento).- Aditivos específicos: Pyr (Piruvato), Glu(Glutamina).
Mantenimiento de un cultivo - Recambio periódico del medio de cultivo:
Eliminación de las sustancias de desecho.Adición de nutrientes según el consumo.
- Control de la densidad celular:
Trasvases de células a otros recipientes.
-^
Mantenimiento de condiciones físico-químicas favorables:
Temperatura (36.5º-37ºC en mamíferos).Humedad (próxima al 100%).Balance gaseoso: O
2
(presión atmosférica)
y CO
2
pH (entorno a 7).Osmolaridad.
Cabinas de flujo laminar: - Impiden la entrada de aire desde elexterior.- Corriente laminar de aire filtrado demicroorganismos.
- Tisulares y organotípicos:
•^
Fragmentos de órganos o un órgano completo.
-^
Se mantiene la organización histológica (cél-cél y cél-matriz extracelular).
-^
Limitación debida al grosor: difusión de nutrientes y oxígeno.
- Cultivos celulares: células aisladas que tienden a formar una monocapa.
•^
Cultivos primarios:
Disgregación enzimática, mecánica o química de un órgano.Siembra de células en las placas de cultivo.Las células suelen conservar la morfología que tenían en el órgano.Crecimiento
in vitro
es lento y limitado, llegando un momento en el que las
células dejan de dividirse y mueren (senescencia).
-^
Cultivos secundarios:
Cuando uno o varios tipos de células de un cultivo primario se re-siembran.Pueden cultivarse durante mayores periodos de tiempo.Diversidad celular restringida, dependiente de los medios de cultivo usados.También se pueden obtener a partir de tejidos tumorales.A partir de ellos se obtienen líneas celulares.
Tipos de cultivos.
FUNDAMENTOS DE FIJACIÓN, INCLUSIÓN Y
CORTADO.
FUNDAMENTOS DE TINCIÓN.
Tipos de fijación: 1.- Física.
Calor: desecación.Frío: congelación rápida. (Ej: N
2
líquido = -196ºC).
Crioprotectores
: evitan la formación de macro-cristales de hielo.
2.- Química. 1. Entrecruzantes: aldehídos como formaldehido, glutaraldehído, paraformaldehído.Forman puentes hidroximetileno entre el fijador y las proteínas. Red 3D.2. Oxidantes: dicromato potásico y tetraóxido de osmio. Microscopía electrónica.3. Precipitantes: desnaturalizan proteínas modificando su estructura terciaria.
a. alcohólicos (metanol y etanol).b. ácidos (acido acético).c. metálicos (cloruro de mercurio).
FIJACIÓN.^ Objetivo Acido pícrico: se crean sales insolubles con las proteínas.
Evita la degradación
post-mortem
del tejido, preservando la estructura y
composición química de la muestra.
Objetivo: Sustitución del agua del tejido por una sustancia dura, facilitando así suseccionamiento.Medios de inclusión: 1.- Hidrofóbicos:
-^ Requieren la deshidratación previa del tejido con etanol enconcentraciones crecientes (50%, 70%, 96%, 100%) y xileno.- Parafina, resinas.
2.- Hidrofílicos:
Gelatina, Agar, Polietilenglicol, Poliacrilamida, etc.