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TEMA 11: REPLICACIÓN DEL ADN
- Modelo de Watson y Crick y replicación: El modelo de estructura del ADN propuesto por Watson y Crick sugería que la replicación se llevaría a cabo utilizando las cadenas del ADN original como molde para la formación de cadenas nuevas.
Se propusieron tres modelos de replicación:
- Replicación conservativa: en la primera replicación forma una doble hélice nueva y una original. En la segunda, hay tres nuevas y una original.
- Replicación dispersiva: en la primera replicación hay dos dobles hélices híbridas y en la segunda, cuatro.
- Replicación semiconservativa: en la primera replicación hay moléculas de ADN híbridas. En la segunda, dos híbridas y dos nuevas.
Meselson y Stahl buscaron validar el modelo de Watson y Crick. Utilizaron la centrifugación en gradiente de densidad para ello. Prepararon una solución de ClCs en un tubo con ADN e isótopos de nitrógeno (^14 N, ligero, y 15 N, pesado). El ADN marcado con 14 N queda arriba y el marcado con 15 N, abajo.
EXPERIMENTO DE MESELSON Y STAHL
Aplicaron el procedimiento anterior a E. coli.
Al aparecer una banda intermedia tras el primer ciclo de replicación, descartaron el modelo conservativo. Con el resto de ciclos descartaron la hipótesis dispersiva , puesto que solo habría banda intermedia. Las cadenas se separan y cada una forma una nueva. El modelo que se adapta a la realidad es el de la replicación semiconservativa.
- Síntesis de ADN "in vitro": Kornberg aisló la primera enzima relacionada con la síntesis de ADN en bacterias: la ADN polimerasa I.
Mezcló un desoxinucleósido trifosfato con ADN duplexo y añadió ADN pol I de E. coli y Mg+ y no obtuvo ningún resultado. En cambio, al añadir ADN mellado o ADN de cadena sencilla, sí se sintetizaba ADN nuevo y se liberaba pirofosfato.
Por tanto, para que la ADN pol I funcionara era necesario un extremo -OH 3' libre. Una cadena de ADN actúa como molde, pero es necesaria la existencia de un cebador o primer.
La ADN pol I sigue una dirección de lectura 3'->5' y de síntesis 5'->3'. Las hebras son antiparalelas y cumplen las reglas de Chargaff.
ADN POLIMERASAS
Hay cinco ADN polimerasas en E. coli :
ADN pol Polimerización 5'->3' Exonucleasa 3'->5' Exonucleasa 5'->3' Función I Sí Sí Sí Elimina y coloca primers II Sí Sí No Reparación y reinicio de la replicación. III Sí Sí No Elongación. IV Sí No No Reparación V Sí No No Reparación y síntesis frente a lesiones.
Las ADN polimerasas tienen características en común:
- Sintetizan cualquier secuencia.
- Añaden los nucleótidos al -OH 3' libre.
- Usan desoxinucleósidos trifosfato para sintetizar ADN nuevo.
- Requieren de cebadores para iniciar la síntesis.
- Catalizan la unión fosfodiéster -P 5' con -OH 3'.
- Producen cadenas nuevas, antiparalelas y complementarias.
- Se asocian con otras proteínas.
- Síntesis de ADN: La replicación debe cumplir los siguientes requisitos:
- Un molde (una cadena de ADN simple).
- Desoxinucleósidos trifosfato como materia prima para formar la cadena.
- Enzimas y proteínas que lean el molde y ensamblen los sustratos para formar una molécula de ADN.
MECANISMO DE SÍNTESIS
Se sintetiza ADN nuevo a partir de dNTP's en una reacción catalizada por la ADN polimerasa.
- Unión del grupo -P 5' al grupo -OH 3' de la cadena en formación.
- Se forman puentes de hidrógeno entre ambas cadenas.
- Se liberan dos fosfatos.
- Se forma un enlace fosfodiéster y se liberan iones fosfato.
DIRECCIÓN DE LA REPLICACIÓN La síntesis de ADN se produce en una estructura denominada horquilla de replicación. Las dos cadenas se sintetizan de manera simultánea, pero en crecimiento opuesto. Además, una se sintetiza de manera contínua, cadena líder , y otra de manera discontinua, cadena retrasada. La síntesis de la cadena retrasada se realiza en fragmentos de ADN cortos, los llamados fragmentos de Okazaki.
REGLAS BÁSICAS DE LA REPLICACIÓN
- Es semiconservativa.
- Es bidireccional.
- Número y tipos de ADN polimerasas.αγδε Hay 13 tipos, pero solo cuatro están implicados directamente: α (actividad primasa), γ (ADN mitocondrial), δ (ADN nuclear) y ε (ADN nuclear). El resto participa en la corrección. - Replicación de telómeros: al eliminar los cebadores del extremo 5', queda un hueco que no se puede rellenar puesto que no hay extremo -OH 3' para sintetizarlo. Se elimina la región equivalente y el cromosoma se acorta. Este proceso es responsable de la muerte celular.
Estas regiones se denominan telómeros y son secuencias cortas repetidas. Una enzima, la telomerasa , replica los extremos y mantiene estables los cromosomas. La telomerasa posee proteínas y ARN. Este ARN coincide con las secuencias del extremo, se ancla donde el cebador y forma ADN nuevo en el extremo 3' (unos 15-22 nucleótidos). Se forma un lazo en esta secuencia añadida lo que deja un -OH 3' libre y permite la replicación. Finalmente, esta región se rompe y se separa.
La telomerasa solo está presente en organismos unicelulares y células germinales. Las células somáticas carecen de ella, solo la poseen las células cancerosas.
- Síntesis de ADN a partir de ARN: los retrovirus. Los retrovirus tienen ARN. Su genoma se inserta en el de la célula huésped. Liberan transcriptasa inversa de su cubierta. Esta enzima es capaz de sintetizar ADN a partir del ARN original. Este ADN duplexo se integra en el de la célula y se encarga de la formación de nuevos virus.
