SecuenciacióndeDNA
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Asignatura: Bioquímica, Profesor: Carlos López- Otín, Carrera: Biología, Universidad: UNIOVI
Tipo: Apuntes
2012/2013
1 / 23
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Secuenciación
de
DNA
Secuenciación
de^ DNA:
Terminadores
de^ cadena
(Sanger)
Molde:
3´‐‐G
A^ A^ T
T^ C^ G^
C^ T^ A^ A
T^ G^ C^
Oligo:
C^ T^ T^ A
A
‐^ DNA^
polimerasa ‐^ NucleótidosdATP,
dCTP,^
dGTP,^ dTTP ‐Terminadores
fluorescentes ddATP,
ddCTP,
ddGTP,
ddTTP
5´‐‐C^ T
T^ A^ A^ G
C^ G^ A^
T^ T^ A^ C
G^ ‐3´
5´‐‐C^ T
T^ A^ A^ G
C^ G^ A^
T^ T^ A^ C
5´‐‐C^ T
T^ A^ A^ G
C^ G^ A^
T^ T^ A^ ‐3´
5´‐‐C^ T
T^ A^ A^ G
C^ G^ A^
T^ T^ ‐3´
5´‐‐C^ T
T A^ A G
C^ G^ A^
T^ ‐3´
5´‐‐C^ T
T^ A^ A^ G
C^ G^ A^
5´‐‐C^ T
T A^ A G
C^ G^ ‐3´
5´‐‐C^ T
T A^ A G
C^ ‐3´
5´‐‐C^ T
T A^ A G
Detector
de fluorescencia
láser
Separación mediante electroforesis capilar de^ los^
fragmentos de DNA^ marcados
- G^ C^ G
A^ T^
T^ A^ C
G^.^.
The cancer genome.
Stratton et
al.^ Nature 9
April 2009
Exigencia
nuevos
métodos
de^ secuenciación:
‐Menor
coste ‐Mayor
capacidad
de^ análisis
-^ 1ª
Generación:
Método
de^
Sanger
-^ 2ª
Generación: – 454
pyrosequencing (Roche)
-^ Solexa
‐Illumina
-^ Ion
Torrent (Life Tech)
-^ 3ª
Generación:
single
‐molecule sequencing
Roche/
FLX^
Pyrosequencer:
‐Basado
en^ pirosecuenciación: ‐ La liberación
de^ pirofosfato
como
consecuencia
de^ la^
adición
de
un^ nucleótido
por^ la
DNA^ polimerasa
desencadena
una^ reacción
en^ cadena
que^ termina
con^ la
emisión
de^ luz
por^ parte
del^ enzima
luciferasa. ‐^ Una^
cámara
CCD^ es
capaz
de^ recoger
la^ luz
emitida,
la^ cual
es
proporcional
al^ número
de^ nucleótidos
incorporados.
-^ Las
bolas^ de
agarosa
son^ depositadas
en^ unas
microcámaras donde
ocurre
la^ reacción
de^ secuencia. • Permite
una lectura
de^1 billón
de^ bases
por^ día.
-^ Cada lectura
permite
un^ promedio
de^400
pb,^ permitiendo
este^ equipo
llevar^ a
cabo^ un
millón^
de^ lecturas
simultáneas
(500Mb
por^ cada
ensayo).
-^ Coste
por^ Mb
de^ $^60
^ $^180000
por^ genoma
(30x:^ $
5,4^ millones)
El^ genoma
de^ Jim Watson
-^ El^ sistema
Illumina emplea
una^ aproximación
de^ secuenciación
por^ síntesis.
-^ Así,
en^ cada
turno^ se
añade
una^ mezcla
de^ los^
cuatro^
nucleótidos
marcados
con^ un
fluoróforo específico
y^ bloqueados
químicamente
en^ su^ grupo
3’‐OH,
asegurando
que^ la
incorporación
en^ cada
caso^ sea
única.
-^ El^ sistema
óptico
del^ equipo
es^ capaz
de^ registrar
la^ incorporación
de^ los^
nucleótidos
en
cada^ una
de^ las^
posiciones.
-^ Después
del^ mapeo
de^ las^
posiciones,
se^ desbloquean
los^ 3’‐OH,
permitiendo
la^ adición
de^ nuevos
nucleótidos.
Ion^ torrent ‐ Método
de^ secuenciación
mediante
síntesis
de^ DNA
‐^ Basado
en^ la^ detección
de^ los
átomos
de^ hidrógeno
que^ se
liberan
como^ consecuencia
de^ la^ polimerización
de^ una
cadena
de^ DNA
‐^ La^ reacción
ocurre
sobre^
un^ chip
que^ integra
directamente
el^ cambio
de^ pH^
producido
por^ la
liberación
de^ los
protones
‐^ Los^
diferentes
nucleótidos
se^ añaden
de^ uno
en^ uno
y^ de^ forma
secuencial ‐ Permite
lecturas
muy^ rápidas
y^ precisas,
con^ bajo
coste^
de^ secuencia
y
equipos
Nanopores sequencing^ •^ Este
método
de^ secuenciación
se^ basa
en^ el^ hecho
de^ que
cada
molécula
de^ DNA
podría
ser^ identificada
por^ las
alteraciones
que
produce
sobre^
las^ corrientes
eléctricas
al^ atravesar
un^ poro
en^ una
membrana. • Cada^ molécula
de^ DNA
tendría
un^ patrón
único^
dependiente
de^ su
secuencia.
3ª^ Generación
-^ Estos
métodos
de^ secuenciación,
a^ diferencia
de^ todos
los^ anteriores,
no^ requieren
la^ amplificación
de^ los
fragmentos
de^ DNA
que^ se
van^ a^
secuenciar.
-^ La^
secuenciación
de^ una
única^
molécula
de^ DNA
permitirá
en^ el^ futuro
reducir
en
gran^ medida
los^ costes
(Objetivo
$^1000
por^ genoma)
,^ pudiendo
llegar^
a^ un
output
de^ hasta
100 Gb por
hora.
-^ HeliScope –^ Pacific Biosciences (SMRT).