SCP2 TRANSCRIPCIÓN
A) Mediante una transfección del plásmido de interés y su integración física en el genoma por
recombinación homóloga.
B) Este plásmido se utiliza como un control negativo del experimento, para ver que el shRNA
que se utiliza como interferencia se une al gen por el sitio de la pol γ-β y no por otra secuencia
de manera inespecífica.
C) Se utilizan dos clones de cada construcción para minimizar los errores que se hayan podido
tener durante la transfección.
D) Son valores relativos porque se parte de una cantidad concreta de mRNA, conocida, la del
clon 1 en la que sólo se expresa la GFP sin inducir con doxiciclina, y la cantidad que vemos es
la cantidad de mRNA de cada muestra dividida por este control y multiplicada por 100 para
obtener el porcentaje. Para calcular este dato hay que partir de un mRNA y por RT y PCR
cuantitativa calcular la cantidad de mRNA de nuestra muestra y dividirlo por la cantidad de
mRNA totales. Para calcular un valor absoluto habría que saber la cantidad de RNA de la célula
de partida.
E) Normalmente, a mayor cantidad de mRNA habrá una mayor cantidad de proteína, de manera
proporcional. Sin embargo, puede haber mecanismos que aumenten la vida media tanto del
mRNA como de la proteína. En este caso, lo que puede estar ocurriendo para que se produzca
una caída del mRNA pero no de la proteína, es que la vida media de la proteína es más larga, y
por tanto, aunque el mRNA se esté degradando, la proteína no tiene por qué hacerlo, y seguirá
detectándose en la célula.
F) Esto puede deberse a que en esta línea celular, los genes que llegan a cabo el metabolismo de
la galactosa se encuentren silenciados, ya sea por compactación de la cromatina, metilación...
Para comprobar esto se podrían hacer estudios del grado de compactación de la cromatina,
como estudios de DNasaI, islas CpG, CHIP seq… y ver si estos genes en realidad están
silenciados.
G) Que no crezcan cuando el nivel de interferencia aumenta puede deberse a que alguna
proteína necesaria para el metabolismo de la galactosa esté codificada por algún gen
mitocondrial, y por lo tanto, al haber interferencia este gen no se estará transcribiendo ni
traduciendo y la célula sea incapaz de crecer en galactosa.
H) Se podría utilizar una PCR cuantitativa del DNA mitocondrial, ya que mediante la técnica de
Southern Blot se necesita recurrir a la radiactividad.
I) Lo que se puede concluir es que las líneas celulares que expresan el shRNA contra el gen de
la pol γ-β en presencia de doxicilina deben poseer menos mitocondrias que las que no lo
expresan. Sin embargo, aunque posean menos mitocondrias, la transcripción del gen no se ve
afectada, ya que el ratio mtProt/mtRNA no varía entre ellas.
J) Se puede deber a que justo en el tercer estadío larvario se necesiten más mitocondrias o
alguna función característica de ellas, como un mayor aporte energético o algún gen esencial
codificado en su genoma.
K) En las moscas, lo que se observa es que la cantidad de proteína total baja mucho con
respecto a la cantidad de RNA mitocondrial. Esto se puede deber a que en las moscas, la
polimerasa γ-β sea necesaria para la traducción de las proteínas, o su estabilidad, y por eso al
utilizar un shRNA contra esta polimerasa se vea afectada la cantidad de proteína.