Supuestos prácticos de transcripción 1
CUESTIONES
Experimento de co-transfección
a) El DNA que se transfecta en ausencia de factor X es el vector quimera, el cual
presenta las secuencias del promotor del gen neurogranina (cuyo control queremos
estudiar) fusionadas con el gen testigo luciferasa, de forma que podamos asociar la
expresión a ciertos niveles de actividad luciferasa. Es necesario un control de
transfección tanto en el mimso plasmido como en plasmidos distintos, ya que la
actividad β-gal nos permite ver cual ha ido la efectividad de la transcripción. Por ello, se
debe hacer la relacion β-gal/luciferasa para ver si la transfección ha sido correcta o no.
b) El valor de actividad Luciferasa refleja unos valores muy bajos (en torno a 700) que
podrían corresponderse con el nivel de expresión basal por parte del promotor cuando
este no es inducido.
La co-transfección en ausencia de factor X se introduce en el experimento como control
negativo, para tomar como referencia estos valores de luciferasa como los propios de
una expresión a nivel basal, ante un promotor no inducido, y así además confirmar que el
factor X es inductor de la transcripción.
c) Sí, los resultados obtenidos sugieren que al menos hay dos regiones esenciales, o que
contribuyan a la inducción de la transcripción, ya que mutaciones en estas regiones
suponen niveles de expresión mucho más bajos a los registrados cuando el factor X se
expresa completo (WT).
Estas regiones, serían en primer lugar, el extremo N-terminal, ya que al suprimir los
primeros 75 aminoácidos la expresión baja hasta unos niveles prácticamente basales. En
segundo, tendríamos la región C-terminal pero no por su extremo (puesto que a
supresión de los primeros 50 aminoácidos no supone apenas diferencia con el WT), sino
a partir del aminoácido 50 empezando por este extremo, ya que al eliminar los primero
100 aminoácidos la expresión vuelve de nuevo a niveles basales. Por último, el hecho de
que la versión mutante 75-300 del factor X tenga una expresión menor que la salvaje
pero mayor que la basal, nos sugiere que estas dos regiones antes mencionadas son
esenciales y necesarias, y que su presencia determina la expresión, pero que además, la
región que precede al aminoácido 350, aunque no es necesaria, sí ha de potenciarla,
pues su ausencia, no impide la expresión pero sí la disminuye bastante.
En relación al retardo en gel:
d) En el carril 1 incubamos con la sonda radiactiva un extracto de proteínas de células
en las que no se ha transfectado la proteína de fusión.
e) En el carril 2 se transfectado en ausencia del factor X, el cual es la proteína cuya unión
al DNA queremos estudiar por lo que sin esta, no hay nada que se una al DNA y por tanto
no hay retardo en el gel.
f) Este punto nos aporta un control negativo en cuanto a la unión proteína-DNA,
asegurándonos que si observamos retraso en gel ha de deberse a la transfección de esta
y no a falsos positivos.
g) En los carriles 5, 9, 11, y 13 se ha aplicado un exceso de oligo frío frente al oligo de
interés marcado radiactivamente. Este oligo es una mezcla de distintas secuencias, lo
