1.#Elemento+#178/#92:+

No!interfiere!en!la!regulación!de!la!transcripción!de!CDE!ya!que!según!los!datos!obtenidos,!la!mutación!por!deleción!de!esta!

parte!posee!el!mismo!nivel!de!transcripción! en!ambas!líneas! celulares(al! menos!en!este! supuesto! experimental!ya!que!por!

delante! de! esta! secuencia! podría! existir! enhancers! u! otras! secuencias! importantes,! que! harían! a! esta! región! como!

importante!en!la!transcripción).!

2.#+Elemento+E#pal+#92/#72:+

Según! los! datos! experimentales! es! un! elemento! importante! para! la! especificidad! de! la! transcripción! (Que! ocurra! en!

determinadas!células)!ya!que!cuando! está!presente!solamente!se!detecta! transcripción!en!la!línea!celular!de!queratinocitos!

además!tras!su!eliminación!se!produce!un!ascenso!en!la!transcripción!de!ambas!líneas!celulares.!Por!ello!podemos!suponer!

que! este! elemen to! esté! reclutando! factores ! de! transcripción! que! inhiba n! la! transcripción! en! célula s! fibroblásticas! (sin!

expresión!génica!de!CadhE),!mientras!que!en!las!células!que!expresan!CadhE!carecerán!de!estos!factores!de!transcripción!o!

bien! expresen! proteínas! que! los! reemplacen!en! su! unión! al! DNA.! además! como! se! indica! en! los! resultados! de! la! tercera!

construcción! se!observa!que!posee!más! expresión!que!en!células!fibroblásticas!esto!puede!ser!debido!a!que!!este! elemento!

de! alguna! mane ra! esté! inhibiendo! parcia lmente! (ligeramente! )! la ! expresión! de! la! línea! MC A3D! debido! a! que! haya! u na!

expresión!/Actuación!basal!del!inhibidor!que!se!une!a!E‐pal!o!bien!existen!otros!factores!de!transcripción!que!en!esta!línea!

celular!que!se!unen!a! E‐pal!de!manera!que! no!permiten!una! transcripción!demasiado!alta!(Que! podría!ser!perjudicial!para!

la!célula).!

3.#Elemento+GC#58/#35+

Este!elemento!está!influyendo!significamente!en!la!transcripción!en!forma!de!activación,!ya!que!las!construcciones!con!una!

deleción! en! esta! zona! disminuye! totalmente! la!transcripción! a! un! nivel! basal! en! ambas! líneas! celulares.!Al!estar!presente!

solamente! la! caja! CAAT,! se! produce! una! actividad! del! gen! reportero! CAT! baja! por! ello! la! función! de! la! caja! CAAT!

seguramente! sea! de!posicionar! la!maquinaria! basal! más!que!alguna!función!de!activación!aunque!con!estos!resultados!no!

podríamos!decirlo!ya!que!deberíamos!de!realizar!experimentos!de!deleción!de!esta!caja.!

En! la! bibliografí a! he! encontrado! que! el! fac tor! de! transcripción+ Sna il! se! une! de! manera! especí fica! a! la! región! E‐pal! en!

células!que!no!expresan!CadhE!de!tal!manera!que!reprimen!su!expresión:!

“la! identiﬁcación! de! factores! de! transcripción! que! interactuaran! con! el! elemento! E‐pal! se! realizó! por! medio! de! una!

aproximación! de!un!híbrido!usando!la!secuencia!E‐pas! (‐90/‐70)!oligomerizada!para!dirigir!la!expresión!del!gen! HIS3!de!S.!

cerevisiae! como ! anzuelo! y! una! bibliot eca! de! genes! de! ADN c! de! NIH3T3! fusionad a! al! dominio! de! activ ación! GAL4! como!

cebo.!Se!aislaron!un!total!de!130!clones,!capaces!de!interaccionar!con!(y!dirigir!la!transcripción!del!gen!informador!HIS3)!la!

construcción! qu e! contenían! el! elem ento! E‐pal! nativo; ! éstos! no! reconocían ! el! elemento! oligom éri‐co! mutado.! Es ta! forma!

mutada!del!elemento! E‐pal!contiene!dos! bases!modiﬁcadas!(TT!en!vez!de!GC),!lo!cual!elimina! la!caja! E2.!Se!ha!descrito!que!

esta! forma! muta da! es! la! responsable! de! abo lir! el! efecto! represor! en! el! pro motor! de! la! E‐cadherina! en ! ratones! “….”La!

secuenciación! d e! los! clones! aislados! reveló! qu e! el! 49%! de! los! mismos! conten ía! insertos! que! codiﬁcaban! la ! secuencia!

completa!o!parcial!del!ADNc!del!Snail!de!ratón!“….!

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1. Elemento 178/ 92: No interfiere en la regulación de la transcripción de CDE ya que según los datos obtenidos, la mutación por deleción de esta parte posee el mismo nivel de transcripción en ambas líneas celulares(al menos en este supuesto experimental ya que por delante de esta secuencia podría existir enhancers u otras secuencias importantes, que harían a esta región como importante en la transcripción). 2. Elemento E pal 92/ 72: Según los datos experimentales es un elemento importante para la especificidad de la transcripción (Que ocurra en determinadas células) ya que cuando está presente solamente se detecta transcripción en la línea celular de queratinocitos además tras su eliminación se produce un ascenso en la transcripción de ambas líneas celulares. Por ello podemos suponer que este elemento esté reclutando factores de transcripción que inhiban la transcripción en células fibroblásticas (sin expresión génica de CadhE), mientras que en las células que expresan CadhE carecerán de estos factores de transcripción o bien expresen proteínas que los reemplacen en su unión al DNA. además como se indica en los resultados de la tercera construcción se observa que posee más expresión que en células fibroblásticas esto puede ser debido a que este elemento de alguna manera esté inhibiendo parcialmente (ligeramente ) la expresión de la línea MCA3D debido a que haya una expresión /Actuación basal del inhibidor que se une a E‐pal o bien existen otros factores de transcripción que en esta línea celular que se unen a E‐pal de manera que no permiten una transcripción demasiado alta (Que podría ser perjudicial para la célula). 3. Elemento GC 58/ 35 Este elemento está influyendo significamente en la transcripción en forma de activación, ya que las construcciones con una deleción en esta zona disminuye totalmente la transcripción a un nivel basal en ambas líneas celulares. Al estar presente solamente la caja CAAT, se produce una actividad del gen reportero CAT baja por ello la función de la caja CAAT seguramente sea de posicionar la maquinaria basal más que alguna función de activación aunque con estos resultados no podríamos decirlo ya que deberíamos de realizar experimentos de deleción de esta caja. En la bibliografía he encontrado que el factor de transcripción Snail se une de manera específica a la región E‐pal en células que no expresan CadhE de tal manera que reprimen su expresión: “la identificación de factores de transcripción que interactuaran con el elemento E‐pal se realizó por medio de una aproximación de un híbrido usando la secuencia E‐pas (‐90/‐70) oligomerizada para dirigir la expresión del gen HIS3 de S. cerevisiae como anzuelo y una biblioteca de genes de ADNc de NIH3T3 fusionada al dominio de activación GAL4 como cebo. Se aislaron un total de 130 clones, capaces de interaccionar con (y dirigir la transcripción del gen informador HIS3) la construcción que contenían el elemento E‐pal nativo; éstos no reconocían el elemento oligoméri‐co mutado. Esta forma mutada del elemento E‐pal contiene dos bases modificadas (TT en vez de GC), lo cual elimina la caja E2. Se ha descrito que esta forma mutada es la responsable de abolir el efecto represor en el promotor de la E‐cadherina en ratones “….”La secuenciación de los clones aislados reveló que el 49% de los mismos contenía insertos que codificaban la secuencia completa o parcial del ADNc del Snail de ratón “….

Para determinar el efecto de Snail como factor de transcripción en el contexto de la región proximal del promotor de la E‐ cadherina (‐178/+92), se subclonó la secuencia completa de ADN del Snail en un vector de expresión (pcDNA3), y se analizó su actividad mediante cotransfección en dos líneas celulares de queratinocitos epidermales de ratón, la MCA3D y la PDV. Ambas líneas se habían caracterizado previamente como poseedoras de un elevado nivel de expresión de la E‐cadherina y de actividad del promotor…. La cotransfección de Snail en células MCA3D y PDV produjo una intensa represión del promotor de la E cadherina (respectivamente, el 95% y 75%), pero no del promotor que contenía la caja E2 mutada (Figura 1). Estos resultados confirman aquéllos obtenidos mediante el procedimiento de examen de un híbrido, y demuestran que el Snail es un represor directo de la transcripción del gen de la E‐cadherina que actúa a través de su unión con la caja E2 del elemento E‐ pal.” Patente “Snail, nuevo marcador de progresión tumoral y proteína diana de nuevos compuestos antitumorales” ES 2 234 619 T “ La caracterización posterior de Snail y E47 ha permitido identificarlos como potentes represores transcripiconales de la expresión de CDE, por unión directa al elemento E‐pal del promotor….Actualmente se está procediendo a la caracterización funcional del mecanismo de represión ejercido por los tres factores sobre el promotor de CD‐E. Los resultados obtenidos hasta la fecha indican que los factores de la familia Snail ejercen su acción represora por reclutamiento de actividades histonas deacetilasas (HDCAs)” Regulación de la expresión de cadherina E y de la señalización de ß catenina durante la progresión tumoral. Memoria 2000‐2001 del laboratorio de Amparo Cano García.IIB. http://www.iib.uam.es/script/memoria.es.cgi?cod_inv=32;ano= El footprinting nos está indicando que en las células de la línea célular MCA3D existe regiones protegidas por proteínas : región +1, región CCA, la región GC, y la caja E‐PAL (además más extensamente que en la otra línea celular) En cambio en la línea celular NIH3T3 nos está indicando que solamente existe una región protegida por una(s) proteína(s) que protege frente a la digestión con DNAasaI que además protege una menor región. Por tanto en la línea celular MCA3D expresa más factores de transcripción que se unen a estas regiones reguladoras que en la línea celular NIH3T3. El carril G+T está indicando los productos de la secuenciación para estas dos baeses mediante el método de secuenciación química de Maxam‐Gilbert, este método consiste básicamente en el tratamiento químico que genera rupturas en una pequeña proporción de uno o dos de los cuatro nucleótidos en cada una de las cuatro reacciones (G, A+G, C, C+T). De ese modo se genera una serie de fragmentos marcados a partir del final marcado radiactivamente hasta el primer lugar de "corte" en cada molécula. Los fragmentos posteriormente se separan por tamaño mediante electroforesis en gel, separando los productos de las cuatro reacciones en cuatro carreras distintas, pero una al lado de la otra. De esta manera podemos saber que bases está afectando el footbprinting y por lo tanto en que secuencias son protegidas de la acciópor las proteínas.

Una aproximación para comprender si es más eficiente la presencia del CAP en su extremo 5’ podría ser la eliminación de este extremo y comparar frente a un ensayo control (Con CAP) las cantidades relativas del citoplasma y núcleo de ambas situaciones. Realizaremos una construcción mediante la purificación y replicación mediante PCR, utilizando oligonucleótidos comerciales para las secuencias anexas. En 5’ colocaremos un promotor en el cual le usaremos para una transcripción in Vitro por ejemplo el promotor para la polimerasa del fago T7. Como no podemos producir una mutación en los genes que traducen proteínas implicadas en el proceso de introducción en el cap ya que esta mutación sería letal podríamos entonces realizar una transcripción in Vitro de este snRNA a partir de un clonaje, marcándole radiactivamente con P32, separando en dos alícuotas, en una de ellas introduciremos la maquinaria necesaria para introducir un resíduo CAP en 5’ y en otra en la que mantendríamos a este snRNA sin CAP. El problema de esta técnica que el KIT para añadir el cap es poco eficaz. Introduciríamos mediante microinyección de oocitos de Xenipus en el núcleo una serie de células (de la misma línea celular para evitar interferencias) con la misma cantidad de RNA a partir de una de estas dos alícuotas (manteniendo ambas poblaciones de células por separado). Dejaríamos incubar una cierto tiempo (con cuidado de que no se produzca una cierta degradación de RNA) y entonces procederíamos a realizar un homogenizado de estas dos poblaciones celulares por separado, después manteniendo las condiciones nativas procederíamos a la separación por centrifugación diferencial de las fracciones celulares de manera que obtendríamos una fracción citoplasmática y otra nuclear. A partir de estas dos fracciones purificaríamos los ácidos nucleicos (por ejemplo mediante una dilución 1:1 con una fase apolar de fenol‐cloroformo isoamílico, de la cual rechazaríamos la parte apolar). Entonces cargaríamos en un gel de agarosa las anteriores purificaciones en carriles separados más marcadores de peso molecular y de concentración de RNA. Una vez realizada la separación por electroforesis realizaremos una autorradiografía , y a partir de ésta podríamos conocer la cantidad relativa (cuantificando la intensidad relativa de radioactividad y gracias a una curva patrón realizada con los marcadores) del snRNA en la fracción nuclear como la citoplasmática tanto en el snRNA con CAP como sin ella. (Además del ensayo de radioisótopos se podría realizar mediante la realización de un Northern y sondas marcadas con digoxigenina o marcadas con P32). Para poder sincronizar a las células podríamos inhibir el transporte con una droga, mantenerlas a temperatura baja después eliminar la droga y la temperatura baja. Otra posibilidad a tener en cuenta es la construcción en dos plásmido bacteriano un plásmido que posea en el extremo 5’ el promotor para la RNApolI‐RNApIII (ya que la transcripción con la RNApI‐RNApIII no produce la formación del CAP) y en el otro el promotor para la RNApII que la tomaremos como control positivo. Ambos Downstream insertaremos el gen de este snRNA seguido (5’‐>3’) de un codón de iniciación de la traducción para un gen testigo por ejemplo LacZ o GFP. Transfectamos células y después observaremos la posición del gen testigo, si ha sido capaz de translocarse al citoplasma, entonces ha podido traducirse proteína por lo que al añadir el sustrato de la enzima se podría ver el producto en el citoplasma. Si el CAP es fundamental para la translocación, el gen reportero no podrá ser traducido por lo tanto no veremos producto en el citoplasma tras añadir el sustrato. Podríamos hacer además la misma construcción (Con un promotor par ala RNApI‐RNApIII y otra construcción par ala RNApII) terminando el gen de U1 con una secuencia en 3’ que no esté presente en la línea celular que estamos presente y podríamos inhibir la transcripción con drogas para después retirárselas a las células y congelándolas para parar la transcripción por lo que romperíamos las células, para ver después en un Nothern con una sonda antisense para la secuencia de 3’ de este RNA en las fracciones citosólicas‐nucleares y así cuantificar el RNA presente en ambas fracciones Si careciendo del CAP (7 METIL‐GUANOSINA 5’ TRIFOSFATO) el RNA es capaz de migrar al citoplasma (ya que veríamos una intensidad mayor en las fracciones citoplasmáticas) significará que el CAP no es realmente necesario para este proceso. Buscando en la bibliografía encontré que en 1992, un grupo del European Molecular Biology laboratory, en colaboración con la universidad de Varsovia publicó un trabajo en el que explica que la región CAP de este snRNA (y se amplió posteriormente a todos los demás) es importante para la exportación citoplasmática de los productos de la RNApII. Una vez en el citoplasma, U1snRNA se acompleja con proteínas SM que la transloca al núcleo por lo que en el experimento anterior deberíamos de eliminar la región que se une a esta proteína.

Bibliografía consultada: “A cap biding protein that may mediate nuclear export of RNApII transcribed RNAs” Izaurralde el al. Jurnal of Cell Biology. vol 118 , nº6 pages 1287‐ 1295 Para este experimento haría un ensayo anterior, comparando la movilidad de los RNA en las células que no posean el complejo ECJ correctamente ensamblado con los que sí los tienen. Realizaría una línea celular transgénica mediante ingeniería genética de tal manera que sustituirá en homocigosis a un componente fundamental del EJC con el mismo gen pero bajo un promotor inducible (por ejemplo puromicina) por lo tanto podríamos “apagar” la transcripción en un momento dado y por ello las células podarían vivir con esta construcción en condiciones con puromicina. (o bien con otros tipos de promotores inaudibles por ejemplo las líneas celulares procedentes de Drosophila transgénicas con este gen pero bajo un promotor inducible por temperatura ) De esta manera podríamos bajo unas condiciones determinadas apagar el gen para EJC, dejar un tiempo de respuesta y después realizar la extracción del RNA a partir de las fracciones nucleares/citoplasmáticas como expliqué en el supuesto 2, y comparar la cantidad relativa de RNA de ambas fracciones teniendo en cuenta un control realizado en condiciones no inductivas. Si en condiciones inductivas registramos una cantidad de RNA baja en el citoplasma podríamos decir que el proceso del splicing es necesario para el transporte Además podríamos realizar un Nothern para un mRNA de un gen de expresión constitutiva con las fracciones nucleares‐ citoplasmáticas con una sonda intrónica. De esta manera podríamos observar niveles del mensajero que ha sufrido splicing o no en ambos compartimentos. Aunque no nos indicaría que el splicing es importante para el transporte, podría ser un apoyo adicional en nuestra hipótesis si no viéramos niveles significativos de RNA con intrones en el citoplasma. Podríamos además realizar un siRNA (si observamos una interferencia alta) con un gen que codifica una protéina importante del EJC y compararla con la situación control.

En fibroblastos los mutantes siempre incluyen el exón 4 aunque en los mutantes D posea mutado el 5’ del intrón 3. Puede ser que esta secuencia sea la reconocida por proteínas y se potencia la inclusión del exón 3 o bien como el exón 4 posee más afinidad para el splicing que el exón 3, como éste no es capaz de incluirse se salta el exón 3 y se incluye en exón 4 que posee más afinidad para el splicing. Como los exones 2‐3 son mutuamente excluyentes entonces se incluye el exón 4. es probable que en un fibrobasto sin mutaciones en C o en D tengan unos factores de splicing más afines a estos sitios de reconocimiento y que, en caso de que hubiera mutaciones en esas regiones haya el reconocimiento necesario para que se dé el RNA de tipo 1. b) mutante a músculo liso En este caso vemos que no se incluye el exón 3 debido a la falta de proteínas que reconozcan el exón 3 (o por la presencia que impida su splicing) Mutante b músculo liso En este caso no se puede eliminar el intrón 2 y el exón 3 no es capaz de incluirse, además de que parece que en este caso pueda que exista una proteína que oculta el poliA en el DNA dependa de alguna forma de la secuencia 5’ de splicing del intrón 2. Al ser mutada, la secuencia de PoliA no es ocultada y por ello se detiene la transcripción. Mutante C del músculo liso: Mutante D del músulo liso

Como expliqué anteriormente es posible explicar los datos experimentales mediante la ausencia de proteínas que reconozcan el exón 3 (o presencia de proteínas inhibidoras) por lo que explicaría que en el mutante a no aparezca el exón 3, en el mensajero maduro pese a que sería factible un empalme E3‐E4. Además como expliqué anteriormente estos dos exones parecen ser mutuamente excluyentes. Supuesto 5: a) la técnica de PCR utilizada para amplificar un mRNA a la forma de cDNA es una RT‐PCR utilizando una retrotranscriptasa viral (de retrovirus) que es una polimerasa de DNA que utiliza como molde RNA y cataliza la reacción de polimerización. Pudiéndose utilizar un oligonucleotido de poliT para realizar la primera copia del DNA y después los oligonucleótidos de las secuencias de los extremos APRA luego utilizando esta cadena como molde realizar una copia de DNA con una PCR clásica Para amplificar el DNA se ha realizado una PCR clásica con taq polimerasa (DNA polimerasa dependiente de DNA termoestable) con los oligonucleótidos complementaria en los extremos 5’ y 3’ del fragmento a amplificar. b) sí. Estos datos experimentales indican que el oligo Q hibrida con el DNA genómico de los tejidos estudiados y no con el Oligo Stop. Por ello quiere decir que existe un único gen de ApoB ( que como es evidente presente en ambas líneas celulares). Las hibridaciones con RNA nos revela que sí que existe una hibridación con el oligo STOP en las células intestinales por ello debe de existir algún tipo de modificación postranscripcional del RNA.

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