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UNIDAD: 1 “ GENERALIDADES DE HISTOLOGÍA”
CAPÍTULO 3
“TECNÍCAS HISTOLOGICAS”
OBJETIVOS DE APRENDIZAJE
- Definir que son las técnicas histológicas.
- Describir las técnicas histológicas más utilizadas en la práctica médica.
- (^) Identificar las técnicas comunes de tinción en histología, la detección de proteínas y ácidos nucleicos por microscopia, así como los métodos especiales en biología celular.
- Explicar cuál es la importancia y el uso de la biopsia por congelación
1. INTRODUCCION
Con el paso de los años, muchos descubrimientos de las ciencias naturales se relacionaron con el desarrollo de nuevos métodos analíticos. Como ejemplos pueden nombrarse la invención y el posterior desarrollo de la microscopia óptica, la microscopia electrónica, la difracción de rayos X, el fraccionamiento celular, la inmunohistoquímica y la tecnología del DNA. Es necesario contar con ciertos conocimientos sobre los principios fundamentales de los métodos aplicados para comprender sus posibilidades y limitaciones y para poder adoptar una postura crítica respecto de la interpretación de los resultados alcanzados mediante los distintos métodos. En consecuencia, para comenzar el estudio de la histología, a continuación se revisarán los métodos histológicos en general.
Otro pilar importante en la asignatura es el descrito a continuación, ya que a lo largo del texto, y en el sitio web complementario principalmente, se observarán Imágenes microscópicas de los órganos, por lo que es necesario e| conocer el método que se utiliza para que esos tejidos lleguen a nuestras manos.
La técnica histológica está conformada por varios pasos con el fin de mantener el tejido muerto mediante reacciones químicas, y por tanto, o en lo posible, el aspecto de las estructuras como en el organismo vivo.
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2. TECNICAS HISTOLOGICAS
¿Cómo se realiza las técnicas histológicas para su estudio en microscopia óptica?
Se realiza por medio de un conjunto de operaciones o pasos a seguir al que se somete una materia para poder observar al microscopio.
Las Técnicas Histológicas incluyen los siguientes pasos:
✓ Obtención de la Muestra.
✓ Fijación de la Muestra.
✓ Deshidratación.
✓ Aclaramiento
✓ Inclusión en Parafina.
✓ Obtención de cortes.
✓ Tinción
✓ Montaje
2.1. Obtención del material: La muestra puede provenir.
- (^) Necropsias o Autopsias : Son las piezas que se obtienen de un cadáver.
- Biopsias : Son trozos de tejido que se obtienen de un sujeto con vida con el objeto de estudiarlos al microscopio y efectuar un diagnóstico histopatológico. Las biopsias pueden ser incisionales (parte del órgano) o escisionales (todo el órgano, por ejemplo un ganglio linfático), o tomarse por medio de una endoscopía o durante una cirugía; en este último caso, la llamada biopsia por congelación permite al cirujano tener la certeza de que extirpó toda la masa patológica y además tener un diagnóstico por parte del patólogo para determinar su siguiente acto. La muestra también puede ser de sangre o una citología exfoliativa
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- Líquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-acética.
- (^) Líquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-acética.
- Líquido de Helly, mezcla Zenker-formol.
- Líquido de Bouin, mezcla picro-formos-acética.
- Liquido de Duboscq-Brasil, o Bouin alcohólico.
Fijadores físicos:
- Desecación.
- Calor seco.
- Calor húmedo.
- Frío.
- Congelación y desecación.
Para Microscopia Electrónica se usan : Glutaraldehído al 2.5%, Paraformaldehído, Tetróxido de Osmio y Permanganato de Potasio. Permiten conservar detalles estructurales finos, ya que otros fijadores como el formaldehido, son muy enérgicos en su acción con las proteínas.
A la izquierda corte de riñón fijado en formol; a la derecha corte de riñón no fijado. Obsérvese que el fijado mantiene su estructura y capta más colorante.
2.3. Deshidratación
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Debido a que el agua representa una gran proporción del tejido se aplica una serie gradual de soluciones acuosas de menor a mayor de agente deshidratante, por ejemplo, Alcohol Etílico o Acetona. Iniciando con alcohol al 50 % , luego con una solución de 60%, 70%, 80%, 90%, 96% y alcanzando de manera paulatina el alcohol al 100 % para eliminar el agua.
2.4. Aclaramiento
Luego de deshidratar el tejido, se pasa a una solución de una sustancia que es miscible tanto con el alcohol como con el medio de inclusión a utilizar (en la mayoría de los casos se utiliza como medio de inclusión Parafina líquida).
La sustancia comúnmente utilizada es el Xileno o Xilol. Se llama aclaramiento ya que el tejido se torna transparente o claro en el xileno, esto se debe a que cambia su índice de refracción. También se pueden utilizar Tolueno, Benzol o Cloroformo como medios de aclaramiento.
NOTA: El alcohol y el xileno disuelven los lípidos de la célula y por lo cual al extraerse también se extraen las grasas y los lípidos de la célula.
2.5. Inclusión en parafina
A fin de que se puedan obtener cortes suficientemente finos para ser observados al microscopio, los tejidos tienen que ser incluidos y envueltos por una sustancia de consistencia firme. Las sustancias usadas para este fin son: gelatina y parafina. El objeto de la inclusión es tener un objeto lo suficientemente duro para su manejo y corte.
La inclusión se logra al infiltrar la parafina liquida o cualquier medio de inclusión en estado líquido al tejido, que disuelve el medio de aclaramiento y penetra en el tejido. Por lo general se coloca la muestra de tejido en un recipiente y se le agrega la parafina fundida a 60º C, colocando la muestra en una estufa de 30 minutos a 6 horas manteniendo la temperatura a 60º C.
Después se coloca la pieza y un poco de parafina fundida en un molde de papel o metal de forma rectangular y se deja solidificar a temperatura ambiente, formándose un bloque sólido de parafina con el trozo de tejido incluido, a este bloque se le denomina Taco.
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La tinción de hematoxilina y eosina (H & E) es el método más utilizado para preparar portaobjetos para microscopía de campo brillante. Las estructuras basófilas, como los núcleos celulares, se tiñen de azul oscuro o púrpura por este método, mientras que el material acidófilo como el colágeno y muchos citoplasmáticos las proteínas se tiñen rosa- naranja.
2.8. Montaje Los cortes en el portaobjetos con una gota de medio de montaje transparente, como resina sintética, para su perfecta adhesión. Se coloca un cubreobjetos para proteger el preparado.
- COLORANTES ÁCIDOS Y BÁSICOS Hematoxilina y eosina La tinción de H & E puede usarse con éxito para estudiar una amplia variedad de tipos de tejidos y órganos. Su estructura es la siguiente: - Hematoxilina: anilina +, se considera un colorante básico con carga positiva neta. Catión. - Eosina: anilina - se considera un colorante ácido con carga negativa neta. Anión. Dentro de la célula encontramos componentes aniónicos, como en los grupos fosfato de los ácidos nucleicos en forma de heterocromatina y nucléolos, los grupos sulfato de los glucosaminoglucanos, los grupos carboxilo de las proteínas, la matriz del cartílago y el retículo endoplásmico rugoso. Al ser aniones con carga negativa, presentan entonces atracción por cationes (carga positiva) y basofilia (afinidad por las bases), y se tiñen con hematoxilina. De manera contraria, los componentes catiónicos de la célula, como los filamentos citoplasmáticos, los componentes de la membrana y las fibras de colágena, al ser cationes con carga positiva presentan entonces atracción por aniones (carga negativa) y acidofiiia (afinidad a los ácidos), y se tiñen con eosina.
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Coloración con Hematoxilina y eosina (H&E). Esta serie de muestras de cortes de páncreas seriados (contiguos) demuestran el efecto de la hematoxilina y la eosina utilizadas solas o combinadas. a. En esta fotomicrografía se ve una tinción con hematoxilina sola. Si bien hay una tinción general de la muestra, aquellos componentes y estructuras con gran anidad por el colorante se tiñen con una intensidad mucho mayor, por ejemplo, el ADN nuclear y el ARN citoplasmático. b. En esta fotomicrografía, la eosina, colorante de contraste, consigue una tinción general de los tejidos al usarse sola. Sin embargo, debe notarse que los núcleos son menos conspicuos que en la muestra teñida sólo con hematoxilina. Después de que la muestra se colorea con hematoxilina y que se le prepara para la tinción con eosina en solución alcohólica, la hematoxilina que no estaba unida con rmeza se pierde, y entonces la eosina tiñe esos componentes para los que tiene gran anidad. c. Esta fotomicrografía muestra el efecto de la tinción con ambos colorantes (H&E). 480 Χ.
La metacromasia. Se define como el cambio de color de un colorante básico, por ejemplo del azul de toluidina al rojo o púrpura. Esto ocurre por la presencia de políaniones en el tejido, que lo hacen reaccionar de modo que el colorante se aglomera y sus propiedades cambian. Como ejemplo, la sustancia fundamental del cartílago formada por una alta concentración de grupos sulfato y fosfato, los granulos de heparina en los mastocitos, y el retículo endoplásmlco rugoso de las células plasmáticas teñidas con azul de toluidina, se verán púrpura o rojo.
Célula cebada teñida con azul de toluldlna. Obsérvense los granulos de color púrpura (metacromasla)
- HISTOQUÍMICA Y CITOQUÍMICA Los procedimientos histoquímicos y citoquímicos se basan en la unión específica de un colorante con un componente celular particular que exhibe actividad enzimática inherente.
- La eosina Es un colorante ácido (rosa) y tiene una carga neta negativa. Reacciona con grupos catiónicos cargados positivamente en células y tejidos, en particular con los grupos amino de las proteínas (estructuras eosinófílas).
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sondas de nucleótidos, para visualizar múltiples sondas al mismo tiempo. Esta técnica es muy utilizada en pruebas genéticas. La autorradiografía utiliza una emulsión fotográfica colocada sobre un corte histológico para localizar material radiactivo dentro de los tejidos.
- Histoquímica enzimática El estudio de la célula no sólo se ha quedado en su morfología, sino que también ha llegado sus funciones. Uno de los métodos que lo ha permitido es la histoquímica enzimática, cuyo fin es la localización de una enzima en un tejido a través de su producto. Inicialmente hay que tener especial cuidado durante la fijación para que se preserve la actividad enzimática. La fijación aldehídica débil suele ser el método preferido. También mediante congelación a -10°C de tejido no fijado se mantiene la mayor parte posible de la actividad enzimática. Se lleva a cabo mediante el uso del sustrato (AB) y la enzima que lo escinde en el producto A + B, y se agrega un reactivo (R) de captura que puede ser un colorante o metal pesado capaz de formar un producto insoluble con A o B: A B+R---------enzima -> AR+B
Las enzimas se caracterizan por la especificidad de su sustrato, lo cual permite su localización histoquímica exacta.
- Inmunohistoquímica
La reacción entre un antígeno y un anticuerpo es en extremo específica. Un anticuerpo, también llamado inmunoglobulina, es una glucoproteína producida por las células plasmáticas provenientes de los linfocitos B en respuesta a una proteína extraña, llamada antígeno.
Se puede aplicar en cortes de tejido previamente fijados o congelados. Los anticuerpos se marcan mediante un enlace químico en una sustancia que puede transformarse en visible (fluorocromos que absorben luz UV y emiten luz visible verde, como la fluoresceína, roja o amarillo). Existen dos métodos de marcado:
a. Inmunohistoquímica directa: Es un procedimiento de un solo paso en el cual se marca el anticuerpo contra la macromolécula con un colorante fluorescente que reacciona con el antígeno dentro de la muestra. La emisión de la señal es de poca intensidad, por lo que hoy ha sido reemplazado casi totalmente por el método indirecto. Puede observarse con un microscopio de fluorescencia o confocal.
b. Inmunohistoquímica indirecta: Recibe el nombre de «técnica del emparedado» y consta de dos pasos. Se hace reaccionar la muestra con un anticuerpo primario no marcado dirigido contra el componente que se desea demostrar, se elimina el exceso que no se fijó y se hace reaccionar con un anticuerpo secundario marcado dirigido contra el anticuerpo primario. De esta forma se aumenta considerablemente la
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señal fluorescente emitida por el tejido. Otra ventaja es que puede utilizarse un solo anticuerpo secundario para localizar la unión de varios anticuerpos primarios diferentes.
En lugar de marcar el anticuerpo con fluoresceína puede conjugarse con otras sustancias o enzimas, como la peroxidasa de rábano, que convierte sustratos incoloros en un producto insoluble de un color específico que se precipita. Otra variante es con ferritina, que contiene hierro para su visualización en el microscopio electrónico de transmisión.
Lecturas recomendadas
Gartner L, Hiatt J. Texto atlas de histología. 3a ed. México: McGraw- Hill; 2008.
Geneser Finn. Histología. 3a ed. México: Médica Panamericana; 2000.
Ross M, Pawlina WT, Histología. Texto y atlas color con biología celular y molecular. 6a ed. Buenos Aires: Médica Panamericana; 2013.
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