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Observación de células y tejidos
La histología es el estudio de estructuras microscópicas de tejidos y órganos, y cómo esas estructuras se relacionan en la morfología con su funcionalidad. Siendo que para cada análisis, varias técnicas pueden ser utilizadas, con eso el entendimiento de distintos aspectos (desde estructuras generales hasta moléculas específicas) de una determinada muestra se torna posible bajo los distintos microscopios y métodos de preparación. La histología estudia células y tejidos en cortes preparados artificialmente, siendo así las muestras no apenas una representación condicionada de la técnica utilizada y no son un observación fiel de esas estructuras en sus estados vivos. Por eso la interpretación histológica siempre debe ser hecha considerando el método de preparación, una vez que eso puede cambiar todo el análisis.
Microscopios
● Microscopio Óptico / de Luz ○ Utiliza luz visible y un sistema de lentes de vidrio ○ Tienen un límite de resolución de aproximadamente 0,2 micrómetros determinado por la longitud de la luz ○ Posibilita la observación de: células, núcleos y tejidos en general ■ No es posible observar la mayoría de las estructuras subcelulares, eso pues son muy pequeñas ■ Por eso generalmente es el microscopio de uso rutinario, una vez que los requieren tinciones para generar contraste y posibilitar la observación ○ Variantes importantes: ■ Campo claro: usado en la histología clásica ■ Contraste de fases: usado son células vivas sin teñir ■ Campo oscuro: usado en objetos pequeños con alto contraste ■ Fluorescencia: usado en moléculas específicas marcadas ■ Confocal: es una serie de cortes ópticos usados en la reconstrucción tridimensional de la muestra. ● Microscopio Electrónico ○ Utiliza un haz de electrones, lo que permite una resolución muy superior a la del microscopio óptico ○ MET - Microscopio electrónico de transmisión ■ Observa la ultraestructura interna ■ Requiere cortes ultrafinos (50-100 nm) ■ Permite la observación de: membranas, ribosomas, mitocondrias y complejos de unión → es fundamental para el estudio de la organización subcelular ○ MEB - Microscopio electrónico de barrido ■ Observa las superficies tridimensionales ■ No posibilita ver el interior ceçiçar
Unidades de Medida
● En histología se utilizan distintas escalas ● La histología clásica trabaja en micrómetros, mientras que las ultraestructuras se estudia en nanómetros
● Milímetro (mm): 10⁻³ m ● Micrómetro (μm): 10⁻⁶ m ● Nanómetro (nm): 10⁻⁹ m
Métodos de Estudio
● Inclusión en parafina → E s el método más utilizado en la histología de rutina, eso pues permite obtener cortes finos y bien conservados, ideal para la observación de la arquitectura tisular, a partir de la tinciones de rutina y la mayoría de las tinciones especiales. Su única falta es que se pierden lípidos y la actividad enzimática ● Inclusión en resinas → Este método puede ser obtenido con materiales como: epoxi, araldite y metacrilatos, es ideal para obtención de corte semifinos(0,5-1μm) y ultrafinos(50-100 nm). Tales cortes son principalmente usado en el estudio con la microscopia electrónica, en la observación de las ultraestructuras, excelente en la preservación estructural, con todo es una técnica más compleja, por eso no es utilizado rutinariamente. ● Microscopía electrónica → Usada en el estudio de ustra estructuras, dependiendo de su método es posible observar estructuras internas como: membranas, mitocondrias, complejos de unión y otros orgánulos, o puede ser utilizada para la reconstrucción tridimensional de las estructura observados. ● Congelación → en este método el tejido es congelado rápidamente y se corta en un criostato, ese proceso evita los pasos de deshidratación y aclaramiento lo que permite conservar lípidos y enzimas activas. Con el uso de técnicas de tinción lipídicas, enzimohistoquímicas,posibilitan un diagnóstico intraoperatorio rápido. Su defecto es que los cortes acaban siendo menos regulares que en preparto en parafina. ● Histoquímica y citoquímica → Son técnicas que utilizan de reacciones químicas para la identificación de determinados componentes celulares. Ejemplos: PAS → carbohidratos / Fosfatasa alcalina → enzimas / Sudan → lípidos ● Inmunohistoquímica → Esa técnica está basada en la reacción antígeno-anticuerpo, lo que permite la observación de proteínas específicas dentro de células y tejidos a partir de anticuerpos marcados con enzimas o fluorocromos. Este método es ideal para identificación celular, diagnóstico tumoral, en la clasificación de neoplasias y en la detección de receptores y proteínas específicas. Su mayor característica es que permite una localización precisa y altamente específica, superando a las tinciones clásicas. ● Radioautografía → Es un método experimental que se basa en el uso de moléculas radiactivas incorporadas a las células. La radiación emitida se detecta mediante a una emulsión fotográfica, formado granos de plata, eso posibilita el estudio de las síntesis de ADN, ARN, proteínas y de la proliferación celular, eso pues aporta información funcional y dinámica, no solo estructural. Siendo así no es una técnica diagnóstica. ● Hibridación in SITU → usa sondas de ADN y ARN marcadas que se unen a secuencias complementarias dentro del tejido lo que posibilita detectar genes específicos,localizar expresiones génicas y relacionas genotipo con localización tisular. Este método está enfocado en la observación de ácidos nucleicos, siendo su variante más moderna la técnica FISH, la cual usa de sondas fluorescentes. ● Cultivo celular → Este método consiste en el cultivo de células vivas fuera del organismo en medios nutritivos controlados, permitiendo así el estudio de la división
● Preservar la consistencia de la muestra (pero algunos fijadores acaban por endurecerlos) Existen dos tipos de fijación: ● Por inmersión: donde la muestra es sumergida totalmente en la solución ● Por perfusión: ese proceso ocurre por medio del sistema circulatorio ○ En esos casos se deja la muestra de 6 a 24h en una solución cuyo el volumen del fijador es de 10 a 20 veces superior a la muestra Los métodos de fijación pueden también ser clasificados si son físicos o químicos: ● Físicos: Desecación, calor seco. calor húmedo, frío y congelación ● Químicos: ○ Simples: Formalina, tetróxido de osmio, alcohol metílico o bicromato de potasio ○ Compuesto: Líquido de Zenker, líquido de Bouin, líquido de Helly y Carnoy
> Deshidratación: Este proceso tiene como principal objetivo extraer la agua de los preparados. Esto se logra por medio de la sumersión seguida de la muestra en una série de soluciones con concentraciones de alcohol creciente, hasta que llegue en una solución de etanol absoluto. Eso todo es hecho ya que la parafina (principal material utilizado en la inclusión) no se mezcla con agua.
> Aclaramiento Un proceso muy similar con la deshidratación ocurre ahora en la etapa de aclaramiento, la única diferencia es que se utiliza una sustancia que sea miscible tanto en alcohol como en parafinas, siendo estas el: XILENO (lo más común) o TOLUENO (usado principalmente en tejidos más delicados), para extraer el alcohol de las muestras.
> Inclusión Después de aclarada, la muestra está lista para ser incluida en un bloque de parafina, eso pues su textura en este punto es muy maleable, o sea, no posibilita que los cortes sean finos suficiente para una observación adecuada. En esta etapa, la parafina es utilizada una vez que su penetrabilidad y consistencia sean ideales para infiltrar en la muestra. Ella entra en su estado líquido a 56-58°C (eses valores puente variar dependiendo de la parafina) temperatura ideal para facilitar la penetrabilidad y aún así no deteriorar el preparado, y se enfría formando el TACO, el bloque necesario para los cortes.
→ Los últimos 3 pasos son una serie continua de etapas
> Corte del material El taco es puesto en el MICROTOMO, maquina cortadora especial la cual corta el bloque de parafina en láminas muy delgadas (~5-10 micrómetros) con una cuchilla de normalmente de acero, o vidrio y diamante, resultando así en secciones del preparado que permiten el paso de la luz a través de ellas. El tipo de micrótomo usado depende del método de preparación utilizado: ● Micrótomo de rotación: usado para cortes en parafina ● Criostato: usado en cortes congelados
● Ultramicrotomo: realiza cortes ultrafinos para MET
> Montaje Esta etapa es donde las láminas son montadas en portaobjetos a través de medios de montaje con: el Bálsamo de Canadá y la Albúmina de Mayer, actualmente existe la resinas sintéticas modernas, que funcionan con sustitutos para estos materiales.
>Desparafinalización Los cortes en parafina son incoloros. Para poder colorearlos es necesario extraer la parafina utilizando nuevamente el sileno o el tolueno ya que son sustancia miscibles con la parafina.
> Rehidratación Esta etapa es literalmente el proceso inverso a la deshidratación, o sea el preparado va a ser sumergido en una serie de soluciones, en la cual la concentración de alcohol es decreciente, hasta que se logre el punto de una solución con 70% de alcohol/agua destilada.
>Tinción En esta etapa distintos colorantes son utilizados para que sea posible analizar las diferentes estructuras tisulares por medio del microscopio. La tinción estándar más usada es con los colorantes hidrosolubles, siendo la combinación más común entre un colorante ácido y un colorante básico. Eso pues, un colorante básico acaba por teñir estructuras ácidas (como núcleos celulares) y la colorantes ácidos acaban tiñendo estructuras básicas ( como el citoplasma y las proteínas) ● Colorantes ácidos: Eosina /Fucsina ácida / Naranja G ● Colorantes básicos: Hematoxilina / Azul de metileno / Azul de toluidina
Técnicas de Tinción
● Técnicas para rutina
> Hematoxilina-Eosina La H&E es la técnica más utilizada en la observación general de tejidos, siendo la base de todo el diagnóstico. La hematoxilina es la responsable por teñir estructuras ácidas como los núcleos de azul/violeta , eso pues es un colorante básico. Ya la eosina es responsable por teñir estructuras básicas como el citoplasma de rosa , teniendo en vista que es un colorante ácido. → Núcleos muy basófilos = aumento en la actividad nuclear → Citoplasma intensamente eosinófilo = necrosis coagulativa
> Azul de Toluidina El azul de Toluidina en definición es un colorante básico con metacromasia, o sea, en general tiñe las estructuras de azul, pero si entra en contacto con ciertas estructuras [ mucopolisacáridos, gránulos ricos en heparina (mastocitos) y cartílagos con la matriz rica en GAGs ] su coloración cambia para púrpura.
> Tinción de Mallory En esa técnica el colágeno se ve azul brillante y la fibrina se ve roja. Normalmente utilizada en muestras de cicatrices, tendones y inflamación fibrinosa
> Tinción de Van Gieson El colorante es una mezcla de ácido pirico ( amarillo ) y fucsina ácida ( rojo ). Esta técnica es ideal para diferenciar colágeno del músculo/citoplasma , eso pues el colágeno tiene mayor afinidad con la fucsina ácida, ya el tejido muscular y el citoplasma tienen mayor afinidad con el ácido pírico. El colágeno se tiñe de rojo intenso, mientraS el musculo y el citoplasma de amarillo. Esa técnica muchas veces es combinada con otras, cuando combinada con la hematoxilina , tiñe los núcleos de negro , ya cuando combinada con la de Verhoeff son la fibras elástinhas que se tiñen de negro. → Esta técnica muchas veces es utilizada en conjunto con la técnica Verhoeff-Van, generando el método de Verhoeff-Van Gieson (VVG)
● Técnicas para fibras elásticas
> Orceína La orceína es un colorante ácido que tiene gran afinidad a la elastina y otras proteínas ricas en desmosinas/isodesmosina. Siendo así es la técnica ideal para identificar las fibra eláticas en arterias, pulmones, piel y ligamentos amarillos, eslo pues tiñe las fibra elásticas de marrón oscuro/pardo mientras el fondo se que en un tono más claro (rosa/amarillo)
> Aldehído Fucsina La aldehído fucsina nada más es que una fucsina básica modificada con un aldehído, tal combinación forma una tinción con alta afinidad por elastina y mucopolisacáridos ácidos. Esa tiñe las fibras elásticas de violeta/ púrpura oscuro →Esa técnica también marca células beta pancreáticas en técnicas especiales
> Tinción de Verhoeff Esa técnica es la mezcla de hematoxilina-hierro-yodo , lo que tiene gran afinidad y se fija firmemente a la elastina. Siendo así es ideal para identificar las fibras elásticas en arterias, piel, pulmones… Las fibras elásticas son tiñidas de negro mientras el fondo es mas claro. Su uso es fundamental para identificación de vasculopatías y aneurismas eso pues posibilita la evaluación de la integridad de las láminas elásticas en arterias
● Técnicas para fibras reticulares.
> Impregnación Argéntica / Reticulina de Gomori La impregnación argéntica funcia sobre el principio que que la fibras reticulares (colágeno tipo III) son argirófilas, o sean reducen los sales de plata formando depósitos de plata metálica negra. Siendo así, fibras reticulares que sostienen parénquimas: hígado, médula ósea, ganglios, bazo… son tiñidas de negro , mientras el fondo se queda gris claro.
● Técnicas para lípidos
> Sudan III Es un colorante lipofílico que se disuelve en las gotas de lípidos neutros. Tal tinción funciona con cortes congelados una vez que lípidos se pierden en preparados con parafina. Tiene afinidad con los triglicéridos y lípidos neutros en general , los tiñendo de naranja/rojizo. Esta técnica es usada en la identificación de grasas en órganos y el tejido adiposo en general.
> Sudan IV Es un colorante liposoluble, cuyo principio activo es similar del Sudan III, la única diferencia es que tiñe los lípidos neutros de un color rojo intenso , siendo principalmente usado en estudios de tejido adiposo, y del depósito de grasa en ciertos órganos.
> Sudan negro/Black B Es un colorante lipocrómico que se disuelve en lípidos. principalmente el presenta en la mielina , los tiñendo de negro , tal técnica es usada principalmente para identividas la mielinización/desmielinización del tejido nervioso, el tejido adiposo, y por veces las células inmaduras de la médula ósea
● Técnicas para el sistema nervioso
> Azul Luxol Es un colorante ácido derivado de ftalocianina que se une principalmente a lipoproteínas de la mielina, ideal para identificarla en el SNC y SNP. Eso pues tiñe la sustancia blanca , que contienen mayor concentración de mielina de azul intenso , mientras tiñe la sustancia gris de violeta más claro Usado para identificar casos de esclerosis múltiple y otras enfermedades causadas por desmielinizaciones. También sirve para lesiones desmielinizantes inflamatorias, tóxicas o metabólicas
● Técnicas para la sangre / médula
> Tinción de Wright La tinción de Wright está basada en la tinción tipo Romanowsky (eosina Y + azul de metileno y derivados), cuyo principio es de la integración ácido-básica con componentes celulares sanguíneos. Tiñe eritrocito , leucocitos, plaquetas en sangre periférica y médula ósea. Siendo que los eritrocitos son teñidos en un rosa-anaranjado , los núcleos de azúl/violeta y los gránulos específicos pueden variar el color. Esta técnica es ideal para analizar el hemograma en frotis sanguíneo, el estudio morfológico de leucemias y el frotis de médula ósea.
>Giesma Es una tinción del tipo Romanowsky, siendo una mezcla de eosina y azules de metileno sulfurados. Es responsables por teñir sangre periféricas, médula óseas, parásitos (Plasmodium, Leishmania) + malaria y algunos microsoft organismo en tejidos (como e H. pylori). Tiñe los núcleos de azul/violeta , el citoplasma se tiñe de azul pálido a rosa , ta los gránulos pueden teñirse de colores distintos dependiendo de la célula. → Puede se presentar junto a las tinción de Wright, eso pues son dos técnicas de Romanowsky.
