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TEMA 5: LINFOCITOS B
RESPUESTA HUMORAL MEDIADA POR LOS LINFOCITOS B
La respuesta innata no es específica, los receptores reconocen patrones moleculares y no necesita crear diversidad.
La respuesta adaptativa es mucho más específica , pues reconoce algo muy concreto que es el antígeno. Dentro de esta respuesta está la humoral , mediada por los linfocitos B que secretan los anticuerpos al torrente circulatorio. Además los linfocitos B también funcionan como células presentadoras.
En la respuesta adaptativa ya tenemos receptores específicos. En los linfocitos B se llama BCR , y son Ig de membrana. La respuesta humoral lleva a cabo respuestas frente a microorganismos extracelulares. Los anticuerpos se unen a ese agente patógeno y a partir de ahí se desarrolla todo el proceso de respuesta inmunitaria.
Las células B van a producir Ig que pueden ser de membrana o solubles (secretadas al torrente). Existen mecanismos de generación de diversidad en células B.
ANTÍGENOS Y ANTICUERPOS
Antígeno : cualquier sustancia capaz de ser reconocida de forma específica por receptores de linfocitos B o T.
Anticuerpo es la proteína capaz de reconocer y unir a los antígenos.
El antígeno es muy heterogéneo: Antígenos proteicos que dan una mayor inmunogenicidad y presentan varios epitopos con diferente especificidad, son los que mayor respuesta van a producir. Antígenos polisacáridos que presentan sitios de unión con la misma especificidad. Antígenos lípidos y ácido nucleicos generan mucha menos especificidad y menos respuesta. Antígenos haptenos (moléculas de bajo peso molecular como metales, fármacos) en sí no producen respuesta inmune pero a veces se unen a una proteína que sí produce respuesta.
Definiciones:
Antígeno : Cualquier sustancia capaz de ser reconocida por TCR, BCR. Proviene de un patógeno o una célula extraña o tumoral. Inmunógeno : Cualquier sustancia capaz de ser reconocida por TCR, BCR y que genere una respuesta inmune. Inmunogenicidad : Capacidad de un antígeno específico para inducir una respuesta inmune. Tolerógeno : Cualquier sustancia capaz de ser reconocida por TCR, BCR y que genere Tolerancia. Hapteno/Acarreador : Hapteno es una sustancia de bajo Pm que puede ser un antígeno pero es incapaz de generar RI si no es en presencia de un Acarreador (PROTEÍNA)
El DETERMINANTE ANTIGÉNICO O EPITOPO es la región del antígeno que es reconocida por el receptor. Pueden ser epitopos conformacionales , que están formados por aminoácidos que no están en una secuencia y se yuxtaponen en el espacio en la proteína plegada, o lineales que es una secuencia de aminoácidos adyacentes (cuando la proteína está desnaturalizada) que reconoce el receptor. Los epitopos neoantigénicos son aquellos que se generan tras una transformación por proteólisis, ubiquitinación, fosforilación… de la proteína inicial.
LA INTERACCIÓN ANTICUERPO ANTÍGENO
El reconocimiento del antígeno por el anticuerpo implica una unión no covalente y reversible. Viene dada por fuerzas no covalentes, de manera que tiene que existir complementariedad estérica. Si fuera covalente habría una estimulación continua de la respuesta inmune. Así que las fuerzas son de Van der Waals, de puentes de hidrógeno, fuerzas electrostáticas e interacciones hidrófobas. Una vez se ha producido esta interacción de especificidad elevada, va a tener también una afinidad elevada: fuerza de unión.
Estos antígenos tienen una estructura similar y difieren solo en la localización del grupo sulfonato en el anillo de benceno. Luego la especificidad viene determinada por la estructura. Una respuesta frente a un antígeno proteico va a ser más fuerte debido a que también se produce una respuesta celular (además de la humoral).
ANTICUERPOS. SUPERFAMILIA DE LAS INMUNOGLOBULINAS
Los anticuerpos son proteínas circulantes que se producen en respuesta a la exposición frente a los antígenos. Son muy diversos y específicos en su capacidad para reconocer moleculas extrañas, y son los principales mediadores de la inmunidad humoral. En la región extracelular posee puentes de disulfuro. En la región citoplásmica es pequeña, luego transmite señales pequeñas. Se acoplan a correceptores que les permite potenciar la señalización.
La Ig de membrana va a formar el receptor de los linfocitos B, que se acopla a otro correceptor que se llama CD79 , con una subunidad alfa y beta, que permite una mejor activación del linfocito. Esta membrana también tiene receptores para el complemento , para que la interacción con el antígeno sea mayor.
Dentro de las Ig tenemos de membrana que forman los BCR, pero también puede presentarse de forma soluble que se secretan. Las de membrana son las D (solo de membrana) y las M (también puede ser soluble).
Su estructura está basada en dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas , unidas por puentes disulfuro , ambas con regiones variables (amino terminal) y constantes (carboxilo terminal). En la región variable radica la interacción con el Ag. En la región constante se va a determinar el isotipos de Ig.
La estructura secundaria de las Ig son láminas beta que se van disponiendo de forman antiparalela para que se vayan exponiendo las zonas de unión.
La mayoría de las diferencias en la secuencia y variabilidad entre diferentes anticuerpos se limitan a tres secuencias cortas en la región variable de la cadena pesada y a tres secuencias cortas en la región variable de la cadena ligera (CDR1, CDR y CDR3). Estas secuencias diversas se llaman regiones hipervariables. Luego tenemos 12 REGIONES HIPERVARIABLES en total que van a determinar la variabilidad de la Ig.
Hay dos clases o isotipos de cadenas ligeras , llamadas kappa y lambda , que se distinguen por sus regiones constantes carboxilo terminales. Una molécula de anticuerpo tiene dos cadenas ligeras kappa idénticas o dos cadenas lambda idénticas. En los seres humanos alrededor del 60% de las moléculas de anticuerpos tienen cadenas ligeras kappa, y el 40% lambda.
La región de reconocimiento del antígeno se localiza en las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras.
FLEXIBILIDAD DE LAS MOLÉCULAS DE ANTICUERPO
Las moléculas de anticuerpo son flexibles, lo que les permite unirse a diferentes series de antígenos. Cada anticuerpo contiene al menos dos zonas de unión al antígeno, cada una formada por una pareja de dominios VH y VL. Muchas moléculas de Ig pueden orientar esas zonas de unión de manera que puedan engancharse a la vez dos moléculas de antígeno en una superficie plana. Esta flexibilidad la confiere en gran parte la REGIÓN BISAGRA.
En A se muestra una molécula de Ig unida a dos epitopos muy separados en una superficie celular.
En B el mismo anticuerpo unido a dos epitopos que están muy unidos.
Un linfocito B con una especificidad antigénica, va a producir anticuerpos de la misma especificidad, igual región variable, pero puede variar la región constante y por tanto la función de la Ig.
5) Tonegawa : Demuestra las hipótesis de Dreyer y Bennet. Proporciona soluciones al problema de la diversidad. Cantidad limitada de genes que permutan de forma casi infinita para dar lugar a inmunoglobulinas con especificidades para todos los antígenos. Novel en 1987 Propone:
**1. Múltiples genes: variables (V) y constantes (C) en la línea germinal.
- Mutación somática
- Recombinación somática entre elementos génicos.** Todo en conjunto crea esa enorme diversidad.
Esa variabilidad en la estructura de las Ig se debe a varios tipos:
Isotípica : (variación en línea germinal generadas por cambios en segmentos constantes de las diferentes cadenas) cada tipo de Ig tiene una función distinta (IgA, IgM, IgD, IgE y IgG) Alotípica : (variabilidad alélica intraespecie, generadas por polimorfismos) cada individuo tiene una secuencia. Las Ig que genera un clon de linfocitos B que crea una persona será distinta a la que cree otra. Idiotípica : (Variabilidad de los segmentos hipervariables). Ésta es la que realmente crea diversidad. Se produce la recombinación en esa región hipervariable.
Para generar diversidad se van a producir unos procesos que van a hacer que se creen infinitas posibilidades para que las Ig reconozcan a todos los antíegnos. El linfocito B ya sale de la médula ósea maduro con sus receptores de membrana (infinitas posibilidades) frente a un antígeno desconocido. Cuando se presente el antígeno el clon específico ya lo reconocerá. En la línea germinal creamos infinitos receptores. Cuando el linfocito va al ganglio linfático interaccionará con el antígeno más afín. Una vez se ha producido el reconocimiento se seleccionan los clones que mayor afinidad tenga con el antígeno. Este proceso de selección se realiza mediante procesos de hipermutaciones somáticas, que van a generar linfocitos de mayor afinidad o con Ig debilitadas que han perdido funcionabilidad. Los que han perdido la afinidad por el antígeno se eliminan mediante selección negativa. Los que han aumentado la afinidad por el antígeno son seleccionados positivamente como células memoria. Todo esto se selecciona por hipermutaciones somáticas.
MECANISMOS IMPLICADOS EN LA GENERACIÓN DE DIVERSIDAD
**1. Múltiples genes V de la línea germinal
- Diversidad combinatorial: VJ y VDJ
- Agrupación de cadenas H con dos tipos de cadenas ligeras
- Mutagénesis insercional o Diversidad N; Adición de N-nucleótidos (x3)
- Conversión genética; exclusión alélica
- Imprecisiones de la recombinación
- Hipermutaciones somáticas en H y L**
La recombinación genética de la cadena pesada precede a la de la cadena ligera. Los segmentos génicos de la cadena pesada tienen que ensamblarse para luego unirse a la cadena ligera.
La información de los dominios variables se encuentra en tres segmentos (V-D-J).
MÚLTIPLES GENES V DE LA LÍNEA GERMINAL
En el extremo 5´de cada locus de cada Ig hay un grupo de segmentos génico V. el número de segmentos génicos V varía considerablemente entre los diferentes loci de Ig y entre diferentes especies.
DIVERSIDAD COMBINATORIAL: VJ Y VDJ
En una cadena ligera, la región variable está codificada por V, J y la región constante por un exón C.
En la cadena pesada, la región variable esta codificada por V, D y J; y la región constante por múltiples exones C
Las inmunoglobulinas funcionales se producen durante la maduración de los linfocitos B en un proceso en el que los segmentos se reordenan, de modo que se colocan adyacentes un segmento de cada tipo de los que intervienen en la codificación de cada tipo de cadena:
- V+J de cadenas L (lambda o kappa) determinan la región VL de la cadena ligera.
- V+D+J de cadenas H determinan la región VH de la cadena pesada.
- En cada caso, el segmento C, se coloca cercano al conjunto ya reordenado de V+J o V+D+J para determinar la correspondiente región constante.
Recombinación de las cadenas ligeras
- Las cadenas ligeras están en dos loci separados – kappa () y lambda () en 2 cromosomas diferentes.
- Expresan cadenas ligeras kappa y lambda.
- Tienen segmentos génicos V y J (no segmentos D).
- Si la recombinación de la cadena pesada es exitosa, ocurre la recombinación de la cadena kappa ().
- Si la recombinación de kappa es exitosa, la célula B expresa IgM con cadenas ligeras kappa ().
- Si la recombinación de kappa no es exitoso, el gen lambda se recombina.
- Si la recombinación de lambda es exitoso, la célula B expresa IgM con cadenas ligeras lambda ().
Los genes regionales (V, D, J) se encuentran flanqueados por secuencias señal de recombinación (RSSs) que son reconocidas por un grupo de enzimas conocidas colectivamente como VDJ RECOMBINASAS. Estas RSSs están compuestas por siete nucleótidos conservados (un heptámero ) que reside cerca del gen que codifica la secuencia seguida por un espaciador (que contiene entre 12 y 23 nucleótidos no conservados) seguidos por un nonámero conservado (9 pares de bases). Estas RSSs están localizadas en sentido 3´a cada segmento génico V, en sentido 5´a cada segmento génico J y flanqueando a cada segmento génico D por ambos lados. Estos son los lados que están implicados en el empalme. Solo se recombinan eficientemente un par de RSSs espaciadoras que no sean idénticas (p.ej. una con un espaciador de 12 nucleótidos se recombinará con otra con un espaciador de 23 nucleótidos). Esto se conoce como la regla del 12/23 de la recombinación. Si esta regla no se cumple el ensamblaje no es correcto, es decir, viene restringido por la distancia de una vuelta de hélice.
SECUENCIA DE ACONTECIMIENTOS EN LA RECOMBINACIÓN VDJ
El reordenamiento de Ig de los TCR representa un tipo especial de recombinación no homóloga del ADN, mediada por las actividades de varios enzimas, algunas de las cuales solo están presentes en los linfocitos en desarrollo, mientras que otras son enzimas ubicas para la reparación de roturas en el ADN bicatenario. El proceso de recombinación V(D)J puede dividirse en cuatro acontecimientos diferentes que fluyen de manera secuencial de uno al siguiente.
- Sinapsis : porciones del cromosoma sobre las cuales se localiza el gen del receptor para el antígeno se hacen accesibles a la maquinaria de recombinación. Dos segmentos codificadores seleccionados (V y J) y sus RSSs adyacentes se acercan gracias a la formación de un asa cromosómica y se mantienen en esta posición para su posterior escisión, procesamiento y unión.
- Escisión : se generan roturas enzimáticas en la doble cadena en las uniones entre la RSS y la secuencia codificadora gracias a una maquinaria que es específica del linfocito. Dos proteínas codificadoras para genes específicos de los linfocitos, llamadas gen activador de la recombinación 1 y gen activador de la recombinación 2 (Rag-1 y Rag-2) forman un complejo tetramérico que interviene en la recombinación V(D)J (Recombinasa VDJ). Rag- y Rag-2 contribuyen a mantener juntos los segmentos génicos durante el proceso de pliegue sinapsis o cromosómica, formando una horquilla covalente. El extremo señal (incluido el heptámero y el resto de la RSS) no forma ninguna horquilla y se quedará como asa descartada. Rag-1 y Rag-2 aparte de regenerar las roturas en la doble cadena, también mantienen los extremos de la horquilla y los extremos del asa descartada unidos.
- Abertura de la horquilla y procesamiento del extremos : después de la formación de roturas en la doble cadena, hay que resolver las horquillas (abiertas) en las uniones codificadoras, y pueden unirse o eliminarse bases de los extremos codificadores para asegurar incluso una mayor diversificación. Artemisa es una endonucleasa que abre las horquillas en los extremos codificadores. Una enzima característica de los linfocitos, TdT añade bases a los extremos rotos del ADN.
- Unión : los extremos codificadores rotos, así como los extremos señal, se acercan y 4exunen mediante un proceso de reparación de roturas de la doble cadena que se encuentra en todas las células y que se llama unión de extremos no homólogos. Varias proteínas y enzimas participan en esta unión de extremos no homólogos.
El prelinfocito B expresa en su membrana la cadena pesada μ, asociada a otras proteínas llamadas sustitutos de cadena ligera , porque tienen una estructura homóloga a las cadenas ligeras kappa y lambda pero son invariantes (idénticas en todos los prelinfocitos B). Todo este conjunto forma el llamado receptor del prelinfocito B o pre-BCR.
El pre-BCR regula el reordenamiento adicional de los genes de Ig de dos formas:
- Si se produce una proteína μ a partir del locus de la cadena pesada recombinada en un cromosoma y forma un pre-BCR, este receptor envía señales que inhiben irreversiblemente el reordenamiento del locus de la cadena pesada de Ig en el otro cromosoma. Si el primer reordenamiento no es productivo, el alelo de la cadena pesada del otro cromosoma puede completar el reordenamiento VDJ en el locus de IG H. de este modo, en cualquier clon de linfocito B, un alelo de cadena pesada se reordena de forma productiva y se expresa, y el otro se mantiene en configuración en línea germinal o se reordena de forma no productiva. Como resultado de ello, un solo linfocito B puede expresar cadenas pesadas de Ig codificadas por uno solo de los dos alelos heredados. Este fenómeno se llama EXCLUSIÓN ALÉLICA , y asegura que cada linfocito B exprese un solo receptor, lo que mantiene la especificidad clonal.
- Estimula el reordenamiento del gen de la cadena ligera kappa, aunque el pre- BCR no es absolutamente necesario para que se de este nuevo reordenamiento. Se ha observado que algunos ratones con el gen inactivado que carecen del gen μ inician reordenamientos génicos de la cadena ligera en algunos linfocitos B en desarrollo (que, por supuesto, no pueden expresar receptores funcionales para el antígeno y continuar madurando).
Linfocitos B inmaduros
Tras el estadio de prelinfocito B, cada linfocito B en desarrollo reordena inicialmente un gen de cadena ligera kappa y, si el reordenamiento está dentro del marco de lectura, producirá una cadena ligera kappa, que se asocia a la cadena μ sintetizada antes para producir una proteína IgM completa. Si el locus kappa no se reordena de forma productiva, la célula puede reordenar el locus lambda y producir de nuevo una proteína IgM completa. La producción de una cadena ligera kappa impide el reordenamiento de lambda, y el reordenamiento de lambda ocurre solo si el de kappa no fue productivo. Como resultado de todo esto, un clon de linfocitos B puede expresar un solo tipo de cadena ligera, es lo que se conoce como fenómeno de exclusión del isotipo de cadena ligera.
El linfocito B que expresa IgM se llama linfocito B inmaduro. Los linfocitos B que son fuertemente autorreactivos son eliminados por selección negativa. Los linfocitos B que no son fuertemente autorreactivos abandonan la médula ósea y completan su maduración en el bazo antes de migrar a otros órganos linfáticos periféricos.
Linfocitos B maduros
Se llama linfocito B maduro a aquel que expresa en su membrana no solo IgM sino también IgD. Los linfocitos B inmaduros que expresan receptores de alta afinidad para los antígenos propios y se encuentran con estos antígenos en la médula o en el bazo pueden morir por apoptosis (selección negativa). Esta eliminación es la encargada del mantenimiento de la tolerancia del linfocito B frente a los antígenos propios presentes en la médula ósea. Una vez que se realiza el tránsito al estadio del linfocito B maduro IgM IgD, el reconocimiento del antígeno lleva a la proliferación y diferenciación. Como resultado de ello, los linfocitos B maduros que reconocen antígenos con elevada afinidad en los tejidos linfáticos periféricos se activan, y este proceso lleva a las respuestas inmunitarias humorales.
Todos los procesos de maduración, que se produce en la línea germinal es independiente de antígeno, pero esto no es del todo cierto porque para que haya una selección negativa es dependiente de la asociación del linfocito con el antígeno propio. Donde alcanza su estadio mayor de maduración y afinidad es en los ganglios linfáticos donde se asocia con el antígeno y con los linfocitos T. la selección negativa se da en la médula ósea, el linfocitos expresa ya las IgM y IgD y es en los ganglios cuando interacciona con los antígenos y se produce la maduración y diferenciación en células plasmáticas. No hay cambio de isotipo hasta que interacciona con los T.
MUTAGÉNESIS INSERCIONAL O DIVERSIDAD EN LA UNIÓN
La enorme diversidad del repertorio de linfocitos B y T se crea no solo mediante combinaciones aleatorias de segmentos génicos en línea germinal que se juntan (diversidad combinatorial), sino también mediante la adición o eliminación aleatoria de secuencias en las uniones entre los segmentos que se han unido (diversidad en la unión).
La mayor contribución a la diversidad de receptores para el antígeno la realiza la eliminación o adición de nucleótidos en las uniones de los segmentos V y D, D y J, o V y J en el momento en que estos segmentos se unen. Una forma en que esto ocurre es cuando las endonucleasas eliminan nucleótidos de las secuencias en línea germinal en los extremos de los segmentos génicos que se recombinan. Además pueden unirse secuencias nuevas de nucleótidos, no presentes en la línea germinal, en las uniones.
Las HIPERMUTACIONES SOMÁTICAS van dirigidas a aumentar la afinidad del linfocito por el antígeno. La maduración de la afinidad es el proceso que lleva a una mayor afinidad de los anticuerpos por un antígeno particular a medida que la respuesta humoral dependiente de T progresa y es el resultado de la mutación somática de los genes de la Ig seguida de la supervivencia selectiva de los linfocitos B productores de anticuerpos (células plasmáticas) con las mayores afinidades.
La enzima clave requerida para el cambio de isotipo y para las mutaciones somáticas es la desaminasa inducida por la activación (AID). La expresión de AID la activan sobre todo las señales del CD40. Para que se dé el cambio de isotipo tiene que haber interaccionado previamente el linfocito B con el T.
CAMBIO DE ISOTIPO (CLASE DE CADENA PESADA)
El cambio de isotipo de la Ig se produce mediante un switch que ocurre a nivel de los genes de la cadena pesada. Consiste en una nueva recombinación de estos genes. En la respuesta a la unión del CD40 a su ligando y a las citocinas, parte de la progenie de linfocitos B activados que expresan IgM e IgD sufre el proceso de cambio de isotipo de cadena pesada, que lleva a la producción de Ac con cadenas pesadas de diferentes clases como α,ү,Ԑ... por tanto, el isotipo de anticuerpo producido por el linfocito B cambia, pero las regiones variables y la especificidad no. El cambio de isotipo se observa en los linfocitos B en los focos extrafoliculares, dirigido por los linfocitos T cooperadores extrafoliculares, y mucho más en los centros germinales, dirigido por los linfocitos TFH. La capacidad de los linfocitos B de producir diferentes isotipos de Ac proporciona una plasticidad notable a las respuestas inmunitarias humorales , al general Ac que realizan funciones efectoras diferentes y que participan en la defensa contra diferentes tipos de microorganismos infecciosos
El cambio de IgM a IgD se realiza mediante un splicing alternativo. Ambas se codifican a partir de un mismo preARNm por procesamiento alternativo.
