Appunti di microscopia | Appunti di Biologia

Micrcopi

Per osservare materiali si usa il microscopio perché si stanno analizzando materiali di

dimensioni veramente piccole (gran parte delle cellule sono troppo piccole per essere

distinte ad occhio nudo). L’occhio umano nelle migliori condizioni ha un potere di risoluzione

di 0,2 mm

NOTA: risoluzione → capacità di distinguere i particolari,l’occhio umano, nelle migliori condi

Non basta l’ingrandimento ma è necessaria anche la risoluzione, ovvero rendere l'immagine

definita. [potere di risoluzione → distanza minima alla quale due punti possono essere

distinti]

Il limite per il microscopio ottico è ben sotto a quello dell’occhio umano (sotto al micrometro),

è possibile vedere anche le strutture cellulari e non solo le cellule stesse. Con la microscopia

non è possibile avere risoluzioni a dimensioni intorno a 100 nm (non sarà possibile vedere

ribosomi, cellule a carica virale o proteine). Per vedere queste strutture è necessaria la

microscopia elettronica a scansione (SEM) o a trasmissione (TEM).

Il microscopio lavora mediante lenti che raccolgono l’immagine di un punto e portano

l’oggetto in un'immagine proiettata ingrandita, la lente devia i raggi e fa sì che convergnano

in un’immagine ingrandita (lente stigmatica). Il fuoco è molto importante, con il microscopio

si muovono le lenti per trovare il piano focale.

NOTA: più l’oggetto è spesso più piani focali ci saranno

Il limite di risoluzione è un altro dettaglio importante, quando si lavora con lenti che

ingrandiscono questo limite è dato da una formula (equazione di Abbè):

𝑟𝑚𝑖𝑛 = 0. 61 λ

𝑛 𝑠𝑖𝑛 α

NOTA: → misura che prende in considerazione un angolo e quello che c’è presente

𝑛 𝑠𝑖𝑛α

tra lente e il campione (indice di rifrazione). Dove n è l’indice di rifrazione del mezzo che

separa il campione dall'obiettivo e dal condensatore; è la metà della larghezza angolareα

del cono di raggi raccolti dall'obiettivo, da un punto tipico del campione ed è sempre minore

di 90°. Questi due dati rappresentano l’apertura numerica NA [ ].

𝑛 𝑠𝑖𝑛α

NOTA: → lunghezza d’onda della radiazione

Quindi quando considero un microscopio ci sono tre fattori che possono influenzare

l’ingrandimento:

-lunghezza d’onda della luce utilizzata: non usata con il microscopio ottico però

viene utilizzata in quando riesco a vedere ciò che fa da interferenza con la luce.

Questa strategia, ovvero cambiare la lunghezza d’onda per avere una capacità di

risoluzione maggiore, viene usata con il microscopio elettronico che usa una

radiazione (raggi X) con lunghezza d’onda molto minore. Usando una lunghezza

d’onda molto piccola si riescono a risolvere cose anche a livello atomico.

-indice di rifrazione: misura del cambiamento di velocità della luce mentre passa da

un mezzo all’altro. La luce si muove a velocità differente in base al mezzo in cui

transita.

-apertura angolare dell’obiettivo [ ]: si può con una lente ingrandire la lente𝑠𝑖𝑛α

aumentando l’angolo e di conseguenza la risoluzione, angolo che sarà sempre

minore di 90°. Questo fa si che l’angolo massimo che posso avere come alfa sia

sempre minore di 90° (essendo <180). Maggiore è l’angolo con cui l'obiettivo è in

2α

grado di raccogliere la luce maggiore è il potere di risoluzione dell'obiettivo. Maggiore

è la distanza N.A (apertura numerica) e minore sarà la distanza di lavoro.

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Micrcopi

Per osservare materiali si usa il microscopio perché si stanno analizzando materiali di dimensioni veramente piccole (gran parte delle cellule sono troppo piccole per essere distinte ad occhio nudo). L’occhio umano nelle migliori condizioni ha un potere di risoluzione di 0,2 mm NOTA: risoluzione → capacità di distinguere i particolari,l’occhio umano, nelle migliori condi Non basta l’ingrandimento ma è necessaria anche la risoluzione, ovvero rendere l'immagine definita. [potere di risoluzione → distanza minima alla quale due punti possono essere distinti] Il limite per il microscopio ottico è ben sotto a quello dell’occhio umano (sotto al micrometro), è possibile vedere anche le strutture cellulari e non solo le cellule stesse. Con la microscopia non è possibile avere risoluzioni a dimensioni intorno a 100 nm (non sarà possibile vedere ribosomi, cellule a carica virale o proteine). Per vedere queste strutture è necessaria la microscopia elettronica a scansione (SEM) o a trasmissione (TEM). Il microscopio lavora mediante lenti che raccolgono l’immagine di un punto e portano l’oggetto in un'immagine proiettata ingrandita, la lente devia i raggi e fa sì che convergnano in un’immagine ingrandita (lente stigmatica). Il fuoco è molto importante, con il microscopio si muovono le lenti per trovare il piano focale. NOTA : più l’oggetto è spesso più piani focali ci saranno Il limite di risoluzione è un altro dettaglio importante, quando si lavora con lenti che ingrandiscono questo limite è dato da una formula (equazione di Abbè): 𝑟𝑚𝑖𝑛 = 0. 61 λ 𝑛 𝑠𝑖𝑛 α NOTA : 𝑛 𝑠𝑖𝑛α→ misura che prende in considerazione un angolo e quello che c’è presente tra lente e il campione (indice di rifrazione). Dove n è l’indice di rifrazione del mezzo che separa il campione dall'obiettivo e dal condensatore; αè la metà della larghezza angolare del cono di raggi raccolti dall'obiettivo, da un punto tipico del campione ed è sempre minore di 90°. Questi due dati rappresentano l’apertura numerica NA [ 𝑛 𝑠𝑖𝑛α]. NOTA : λ→ lunghezza d’onda della radiazione Quindi quando considero un microscopio ci sono tre fattori che possono influenzare l’ingrandimento:

lunghezza d’onda della luce utilizzata : non usata con il microscopio ottico però viene utilizzata in quando riesco a vedere ciò che fa da interferenza con la luce. Questa strategia, ovvero cambiare la lunghezza d’onda per avere una capacità di risoluzione maggiore, viene usata con il microscopio elettronico che usa una radiazione (raggi X) con lunghezza d’onda molto minore. Usando una lunghezza d’onda molto piccola si riescono a risolvere cose anche a livello atomico.
indice di rifrazione : misura del cambiamento di velocità della luce mentre passa da un mezzo all’altro. La luce si muove a velocità differente in base al mezzo in cui transita.
apertura angolare dell’obiettivo [ 𝑠𝑖𝑛α]: si può con una lente ingrandire la lente aumentando l’angolo e di conseguenza la risoluzione, angolo che sarà sempre minore di 90°. Questo fa si che l’angolo massimo che posso avere come alfa sia sempre minore di 90° (essendo 2α<180). Maggiore è l’angolo con cui l'obiettivo è in grado di raccogliere la luce maggiore è il potere di risoluzione dell'obiettivo. Maggiore è la distanza N.A (apertura numerica) e minore sarà la distanza di lavoro.

NOTA: gli obiettivi che usano l’olio sono quelli che lavorano a distanza estremamente ravvicinata Il limite di risoluzione dei microscopi Il limite di risoluzione può essere migliorato (diminuito):

diminuendo λ
aumentando l’apertura numerica

Microscopi

Geometria di un microscopio La geometria è la stessa per tutti i microscopi:

sorgente di luce oppure radiazioni
lente che serve per condensare la luce emessa dalla sorgente sul campione
vetrino che contiene il campione, che interferisce con la luce
sistema di lenti che ingrandisce l’immagine e che portano l'immagine all’osservatore Nella microscopia elettronica al posto delle lenti sono presenti dei magneti perchè in questo caso si lavora con dei raggi e al posto dell’osservatore avrò uno schermo; in questo caso il campione deve interferire con un fascio di elettroni e per questo deve avere specifiche caratteristiche. Anatomia di un microscopio
stativo : corpo del microscopio, punto da cui può essere spostato un microscopio
vite macro e micrometriche: le due viti che mettono a fuoco. Regolano la distanza tra il campione da osservare e l’obiettivo, alzando o abbassando il tavolino traslatore. Sono responsabili della messa a fuoco del campione. La vite macrometrica permette di compiere movimenti ampi, consentendo una regolazione grossolana. La vite micrometrica consente di compiere una regolazione più fine.
diaframma di campo : permette di regolare l’ampiezza del fascio di luce che arriva al condensatore in relazione all'obiettivo scelto. Prima di questo sistema è in genere inserito un banco di filtri che permette di cambiare il colore della luce bianca proveniente dalla fonte luminosa. La fonte luminosa è costituita da una lampada alogena o led (munita di sistemi di allineamento e di reostato per la regolazione dell’intensità) che produce una luce bianca.
condensatore : si trova tra il diaframma di campo e l’oggetto da analizzare e serve a mettere a fuoco la luce sul campione. Sul lato sinistro del condensatore è presente una manopola che serve a regolare la distanza dal campione: minore è la distanza (più vicino) e la luce sarà focalizzata sul campione; se la distanza è maggiore allora la luce che raggiungerà il campione sarà poco intensa diffusa. Come regola generale, il condensatore vicino al campione è usato nel caso in cui il campione è colorato, mentre il condensatore posto lontano dal campione serve ad aumentare il contrasto di campioni non colorati. Anche il condensatore può essere dotato di diaframma che regola la quantità di luce da dirigere sul campione. - tavolino traslatore: presenta una molla metallica per bloccare il vetrino e serve da base di appoggio per il campione da osservare. Le due manopole sulla destra muovono il tavolino avanti e indietro, a destra e a sinistra, consentendo di analizzare l’intero campione.
oculari : dove si posizionano gli occhi, nei microscopi moderni sono quasi sempre due con ingrandimento 10x; hanno la possibilità di regolare la distanza interoculare e hanno una messa a fuoco differenziale. I microscopi da ricerca sono muniti spesso

campione non entra nell’obiettivo direttamente; risultano quindi chiari solo gli oggetti che diffondono o diffrangono mentre il fondo risulta scuro. Può essere una soluzione che permette la visione di alcune strutture senza colorarle→ viene illuminato il campione con un angolo differente che non entrerà dentro l’obiettivo, si vedrà nero in ogni punto tranne in quelli in cui il campione devia il campo di luce (uso la geometria della luce). Tecnica di contrasto di fase E’ la tecnica per oggetti trasparenti e che non diffondono. Nell’attraversamento del campione la luce subisce però un cambiamento di fase che può essere sfruttato per creare interferenza con il fascio diretto (tecnica usata per il conteggio delle fibre di amianto). I cambiameti nell’intensità luminosa sono percepiti dall’occhio come zone più chiare e zone più scure. Il contrasto è ottenuto grazie al cambiamento di fase del raggio luminoso che attraversa una certa regione dell’oggetto esaminato. In particolare, la fase del raggio luminoso può essere cambiata a seconda della consistenza del materiale che attraversa. Questi cambiamenti sono da attribuire alla diversa velocità con cui le diverse lunghezze d’onda attraversano il materiale; zone più chiare e zone più scure permetteranno di visualizzare il campione in esame. L’osservazione in contrasto di fase permette l’osservazione di cellule vive trasparenti; il cambiamento di fase della luce indotto dal campione è utilizzato per generare contrasto. Microscopio a fluorescenza In questo caso presenta una lampada attaccata nella parte dietro (oltre alla lampada dietro), questo permette di avere una geometria differente e illuminare il campione da sopra. Essendo dietro la lampada, deviata da uno specchio dicromico, il campione viene illuminato da sopra → è possibile vedere solo la luce che viene emessa dal campione e non quella usata per illuminare il campione. Quando illuminiamo una molecola succede che l’energia del fotone che è stata assorbita porta l’elettrone dal livello energetico base a uno stato eccitato, questo è il motivo per cui una molecola assorbe la luce (esiste un livello energetico eccitato che ha la stessa energia del fotone). Se quella molecola ha un livello eccitato che ha la stessa energia del fotone che colpisce la materia, questo elettrone può “saltare” a un livello energetico superiore (stato eccitato). Lo stato eccitato tende a perdere subito un po’ di energia vibrazionale sotto forma di calore, una volta fatto questo, nell’arco di pochi nanosecondi decade ed emette un fotone con energia diversa dal fotone che è stato assorbito. Una molecola viene eccitata, viene colpita con un fotone, assorbe la luce e la molecola stessa emetterà luce (con una lunghezza d’onda maggiore). Questo processo è usato per vedere la luce perchè illuminiamo con una lunghezza d’onda (es. luce blu) che colpisce il campione, la molecola fluorescente isi eccita ed emette luce di lunghezza d’onda differente che sarà diretta in tutte le direzioni. Con l’oculare si vede la luce emessa che entra nell’obbiettivo. Sono presenti filtri che bloccano l’ingresso della luce che non dovrebbe entrare. Questo processo spiega perchè quando osserviamo il campione con il microscopio a fluorescenza lo sfondo risulterà nero → si vede solo dove c’è emissione. La fluorescenza si usa con delle sonde, è necessario rendere il campione fluorescente (pochi sono i campioni fluorescenti in natura → clorofilla). Per fare questo si usano delle sonde chimiche che si legano alla struttura specifica in modo che risulti visibile. Si può anche legare una sonda a una proteina in modo che la stessa risulti fluorescente. Il caso dell’immunofluorescenza è un caso in cui viene marcato l’anticorpo che andrà a legarsi nella struttura che voglio analizzare. Questo processo può essere fatto con anticorpi specifici oppure usando anticorpi secondari. Sono presenti anticorpi primari specifici per un determinato bersaglio; gli anticorpi secondari sono invece in grado di legare un anticorpo

primario di una qualsiasi specie. Il vantaggio di avere un anticorpo secondario è il fatto che è l’unico che deve essere reso fluorescente che riconosce l’anticorpo primario (evita di dover marcare tanti anticorpi uguali - primari rilevati dal secondario). Possono essere rese fluorescenti le proteine direttamente, alcuni genti,... La fluorescenza può essere utilizzata in modi diversi con il fine di ottenere marcatura. Si possono usare anche sonde che diventano fluorescenti nel momento in cui si trovano in un determinato ambiente. La microscopia confocale in fluorescenza Anche nel microscopio confocale si riconosce una sorgente di luce non sotto al campione ma bensì laterale e uno specchio che fa arrivare la luce al campione. A differenza dell’altro microscopio la luce è ad altissima intensità e molto ristretta come banda (fascio laser). Questo da la possibilità di illuminare il campione anche se questo presenta molti piani (campione spesso). Questa sorgente di luce potente permette di avere una buona eccitazione in tutto lo spessore del campione. La raccolta dell’immagine è direttamente digitale, si ha quello che viene definito pinhole (è una specie di diaframma) → finestra che permette di raccogliere la luce in modo specifico su un unico piano focale, può essere mosso dall’operatore. Questo permette di raccogliere immagini piano focale per piano focale. Se unisco ogni piano riesco ad ottenere un’immagine tridimensionale (con ogni piano a fuoco), a questo si aggiunge il fattore tempo → posso osservare la cellula durante il trascorrere del tempo. Posso avere misure estremamente precise anche nel tridimensionale (volume, profondità,...). Un’altra differenza è la definizione delle immagini tra il microscopio a fluorescenza normale e quello confocale, che permette di avere un’immagine estremamente definita. Sonde e proteine fluorescenti Una delle molecole che viene usata più frequentemente per la fluorescenza è la fluorescina, molecola che presenta doppi legami coniugati (una cosa che rende fluorescente una molecola è la presenza di elettroni delocalizzati) che creano dei sistemi di nuvole elettroniche che aumentano i livelli energetici raggiungibili dagli elettroni eccitati, questo rende le molecole eccitabili (assorbono ed emettono luce). Posso usare anche proteine fluorescenti, questo permette alla cellula di esprimere la fluorescenza (non devo inserire la sonda). Le proteine fluorescenti sono state una grande scoperta, non presentano un fluorofaro legato ma è l’amminoacido stesso che, a causa di una modificazione chimica, creano un gruppo fluorescente (è la proteina stessa che lo è). Queste proteine sono state scoperte da una medusa (Aequorea victoria) che ha la caratteristica di assorbire la luce blu e di emettere in luce verde. Illumino con luce blu e l’emissione è verde. Posso usare il gene, inserirlo nelle cellule interessate e usarlo come gene reporter NOTA : geni reporter → serve a identificare le sequenze di DNA preposte alla regolazione dei geni. L’espressione della GFP (green fluorescent protein) in diversi organismi, tra cui le piante, è utile per lo studio di patterns di espressione genica e come tag per seguire specifiche proteine in cellule vitali. Cambiando alcuni amminoacidi del gene cambia anche il colore della fluorescenza perchè varia la nuvola elettronica, in laboratorio sono stati creati numerosi colori differenti di fluorescenza.

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