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Lezione 16 – 27/11/ Sbobinatore : Chiara Drago Controllore : Lucia Clemente Riepilogo Metodi per valutare quante cellule sono presenti in un campione: diretti e indiretti. Metodi diretti : conta totale. Usando dei vetrini che hanno delle camere con un volume noto e andando a contare al microscopio quante cellule sono presenti nel campo visivo, facendo più conte e facendo delle medie, riportando a volume iniziale. Però è un metodo che non ci dice se i batteri sono vitali e non dice quali batteri ci sono, a meno che non si fanno delle colorazioni specifiche. Metodo della conta vitale: si hanno su piastra i microrganismi, tant'è che si parla di CFU , cioè unità formanti colonie , quindi è il numero di batteri, in quanto un batterio, nel terreno di coltura, comincia a dividersi perchè trova sostanze nutritive e localmente forma la colonia. Quindi la colonia parte da una singola cellula che si è fermata in quel punto. Quindi, con la conta vitale, si ha la possibilità di contare il numero di cellule vitali in quanto si sono divise (una cellula morta ovviamente non si divide) e si può sapere cosa c'è nella piastra, perchè ci si può rendere conto visivamente se c'è un contaminante. Quando si fa la conta vitale bisogna ricordarsi di riportare il valore dei CFU ad un'unità di misura. Quindi bisogna sempre riportare ad ml il campione o grammo di campione. La cosa importante, però, è che se un campione è troppo concentrato, come ad esempio un campione fecale, che contiene tanti tipi di microrganismi, quindi, se si va a mettere direttamente un grammo di feci, diluito in una soluzione fisiologica, (quindi sale allo 0,9%), e poi lo si semina, si avrebbe un tappeto di cellule che non si possono contare. Quindi quando si lavora con le conte vitali è importante seminare su piastra un numero di batteri contabile. Siccome non sappiamo prima quanti batteri ci sono, si fanno varie diluizioni, di solito in base 10 e poi si semina, e si deve sapere di quale diluizione si è seminato il volume seminato. Si seminano più diluizioni, per spatolamento, in maniera tale da averle tutte omogeneamente nella piastra e il giorno dopo si vede il numero di colonie contabili e si riporta al peso o al volume iniziale del campione. Metodi indiretti: sono quelli che non fanno vedere il numero dei batteri presenti nel campione ma si va a stimare un parametro che indirettamente è correlato con la crescita. Perchè se noi abbiamo, più torbidità di una sospensione batterica, più acido nucleico, più ATP, o più proteine, vuol dire che ci sono più cellule. Quindi una sospensione batterica diventa da meno torbida a più torbida man mano che passa il tempo se i batteri si dividono, invece rimane alla stessa torbidità se i batteri non si dividono. La quantità di ATP non cambia nel tempo se non si dividono, mentre aumenta se si dividono. Oppure il peso secco che si deve calcolare rispetto al peso bagnato al wet, perchè bisogna eliminare tutte le gocce d'acqua, perchè il campione può avere una goccia, un altro due gocce e questo va a modificare il parametro. Oggi si usano le colorazioni con coloranti per cellule vitali o per cellule morte.
Curva di crescita
E' una curva che viene fatta in un laboratorio, usando uno dei metodi precedentemente descritti, in cui vengono riportati uno dei parametri che indica una crescita di una popolazione batterica (con uno dei metodi di prima: conta totale, conta vitale, lettura allo spettrofotometro per vedere la densità ottica, quantità di ATP, di acidi nucleici, di proteine, ecc) e si osserva come varia questo parametro, che sceglie l'operatore in base alle sue possibilità, di laboratorio o in base al microrganismo con cui sta lavorando. Quindi studia come cambia la crescita nel tempo. Quando si fa questo lavoro con Escherichia coli, in questo grafico che rappresenta una curva di crescita, noi abbiamo il numero di cellule vive, rispetto al tempo che passa. Quindi vediamo nel tempo cosa succede. Quando si vuole costruire una curva di crescita o si vuole studiare la velocità di crescita di una popolazione batterica in una determinata condizione ambientale si deve lavorare con un terreno liquido, perchè in un terreno liquido noi abbiamo la possibilità di prenderne un'aliquota e analizzarla con uno dei metodi precedentemente detti. Mentre, se
abbiamo la colonia su piastra non si può dividere la colonia per vedere quanti batteri che ci sono. Come si fa una curva di crescita: si inoculano i batteri in coltura pura, (perchè dobbiamo valutare il parametro di crescita di quella popolazione batterica), prelevandoli anche da un'ansata da piastra, in un terreno liquido, che può essere contenuto o in una beuta (che sono quelle larghe sotto e sopra coperte con tappo di bambagia),oppure nei tubi da inoculo, (che sono dei tubi di vetro che hanno un coperchio non chiuso sigillato in quanto deve entrare l'aria perchè i batteri sono aerobi). Tutto deve essere già sterilizzato perchè non dobbiamo immettere microrganismi durante la crescita. Quindi si introduce, dentro la beuta o dentro il tubo da inoculo, una quantità di terreno di coltura in cui sappiamo che il batterio cresce. Ovviamente varia perchè i volumi sono diversi: nei tubi da inoculo non si mettono più di 3ml, mentre nelle beute dipende da qual è il loro volume, ci sono quelle da 150ml, quelle da 500ml, 1L, 2L, ecc. E si inseriscono i batteri, cioè la coltura pura. La professoressa descrive cosa si farà in laboratorio: quello che si farà è prendere un'ansata di Escherichia coli (che è un batterio gram negativo), che si troverà strisciato su piastra. In un tubo da inoculo, verranno messi dentro 3ml di terreno di coltura, che sarà l' LB ( Luria-Bertani Broth ), che è un terreno di coltura ricco, in cui sappiamo che E. coli cresce, quindi verrà messa l'ansata di batteri e, dopo averlo chiuso, si metterà ad agitare ad una temperatura costante: E. coli cresce a 37° (cresce anche a 30°, ma più lentamente). Si mette in agitazione perchè così i batteri consumano tutti la stessa quantità di ossigeno. Se tenessimo ferma tutta la coltura, nella parte sopra ci sarebbe molto ossigeno, che è la stessa quantità di quella atmosferica, che è il 20%. Per cui, se i batteri sono sopra si trovano con il 20% di ossigeno; man mano che si scende lungo la provetta, di ossigeno ne arriva sempre di meno; se il volume della coltura è molto grande sotto non ne arriva. Quello che si noterebbe il giorno dopo è che sopra sono cresciuti più batteri perchè avendo ossigeno hanno fatto respirazione aerobia, per cui per ogni molecola di glucosio che hanno scisso hanno fatto 38 molecole di ATP, per cui sono molto attivi. Sotto invece, fanno un altro tipo di metabolismo, ad esempio la fermentazione, e per la stessa quantità di glucosio producono solo 2 o 4 molecole di ATP, e quindi crescono più lentamente. Infatti, se noi ci dimentichiamo di incubare dei batteri in agitazione, il giorno dopo troviamo una patina sopra, nell'interfaccia con l'aria e molti di meno sotto, che è sempre torbido, ma di meno, quindi ci troviamo in una condizione eterogenea. Invece noi vogliamo che i batteri siano nella stessa condizione, quindi mettiamo in agitazione, così che l'ossigeno mescola e permea tutto e arrivi ovunque nella coltura e tutti i microrganismi possano fare lo stesso tipo di metabolismo. Se invece dobbiamo studiare un metabolismo senza l'ossigeno, dobbiamo levarglielo, e ci sono metodi per farlo. Con Escherichia coli lavoriamo in aerobiosi perchè sappiamo che gli piace l'ossigeno, ma se dovessimo lavorare con un anaerobio bisogna levarglielo. Però è importante che se dobbiamo fare una curva di crescita, o vedere come cresce quella popolazione, che tutti i batteri siano nella stessa condizione: non può essere che alcuni batteri facciano respirazione e altri fermentazione, devono fare tutti lo stesso metabolismo. Quindi inoculiamo i batteri, li mettiamo in una beuta o in un tubo da inoculo, lo mettiamo in agitazione, che vuol dire di solito 280/200 rivoluzioni per minuto; questo fa si che il liquido, mescolandosi, e tutto l'ossigeno permei per bene tutta la coltura. Prima di incubare possiamo prendere il valore al tempo zero: cioè, quando prendiamo l'ansata con i batteri, questa è molto compatta, quindi bisogna renderla omogenea e per farlo si usa il Vortex. Il Vortex ha una forma che permette l'entrata del tubo oppure può avere una forma gommosa piatta. Serve a muovere velocemente, ovviamente deve essere chiuso. Mentre l'agitatore magnetico si mette dentro un magnete , serve per le soluzioni, non si usa per mescolare una soluzione perchè il magnete può contaminare il campione sterile. Quindi abbiamo mescolato e reso omogenea la soluzione batterica, e questo è il punto di partenza della curva, il tempo zero. Si va a misurare il parametro che si è scelto di misurare e lo si segna nel quaderno. Se si è fatta una coltura di 30ml, si prendono ad esempio 500 microlitri, (quindi un sessantesimo di questa coltura) e si analizza di questi 500 microlitri uno di quei parametri, considerandolo rappresentativo di tutto il resto. Segnare il numero di batteri al tempo zero. Quando si fa una curva di crescita si può avere un'idea del batterio che si sta studiando, oppure no. Se non si
fanno il loro metabolismo, si accumulano sostanze acide, e il pH si abbassa. Per cui si va incontro alla fase di morte, che è l'esatto opposto della fase esponenziale, nella quale gli organismi aumentano alla massima velocità a quelle condizioni, invece qui vanno in lisi e anche se idealmente i nutrienti rilasciati potrebbero essere utilizzati da altre cellule, non succede perchè l'ambiente è diventato troppo ostico perchè gli altri possano crescere, ad esempio il pH basso, o i metaboliti di scarto del metabolismo. Ripete: Questa (grafico precedente) è la curva di crescita standard di Echerichia coli, con una fase di adattamento, se il microrganismo cambia terreno; una fase esponenziale, nella quale avviene la scissione binaria di tutte le cellule, alla stessa velocità, che può cambiare in base alle condizioni in cui i batteri si trovano; una fase stazionaria in cui c'è un equilibrio nel numero di morti e vivi; e una fase di morte in cui aumentano i morti. La fase di accelerazione e decelerazione sono quelle in cui, all'inizio e alla fine della fase esponenziale, non tutti sono perfettamente sincronizzati, o nel cominciare a dividersi o nello smettere di dividersi.
Per capire quando si sta parlando di curva di crescita lo si
può fare da due parametri: dobbiamo avere il tempo e un parametro che ci indica la crescita, in questo caso (immagine a sinistra) OD600, che è l'assorbanza, quindi la misura della torbidità. Per misurare l'OD600 si utilizza lo spettrofotometro, e si mette sempre il bianco che è il terreno senza i batteri. Descrizione delle due curve: in quella rossa manca la fase lag, infatti cresce subito, mentre in quella nera fino a tre-quattro ore si mantiene il numero di microrganismi costante. Questo vuol dire che i microrganismi, mentre nel caso di quella rossa venivano dallo stesso terreno in cui li abbiano inoculati, in quello nero provengono da un altro terreno. Per quando riguarda la velocità di crescita, entrambe sono uguali in quanto le pendenze sono uguali. Un modo matematico per calcolarlo è con il coefficiente angolare. Quale di queste accumula più biomassa? Quella nera per poco, perchè sono su per giù identiche.
Curva diauxica
Operone lac: i batteri mangiano il glucosio, che reprime gli enzimi che servono a degradare il lattosio, in quanto, fino a quando il glucosio c'è, il lattosio non viene mangiato, appena però il glucosio finisce, gli enzimi che servono a degradare il lattosio vengono sintetizzati. Quindi, se il batterio si trova in presenza di due fonti di carbonio alternative, i batteri mangiano sempre solo una fonte di carbonio alla volta, anche se ne hanno due. La repressione da catabolita è stata studiata con l'operone lac ma vale anche per altre fonti di carbonio. I batteri scelgono la via metabolica più produttiva e soltanto quando finisce una delle due fonti di carbonio, cominciano ad usare l'altra. Nel caso dei batteri che cominciano ad usare il lattosio, fino alla fase stazionaria usano il glucosio, poi il glucosio finisce, invece di entrare in stazionaria siccome c'è il lattosio, la mancanza del glucosio, toglie la repressione da catabolita e vengono sintetizzati tutti gli enzimi per usare il lattosio. Quindi la fase “finta” stazionaria, che in realtà è una fase di adattamento, poi cresce di nuovo, perchè sta volta stanno mangiando il lattosio, che prima non potevano mangiare. Quindi si parla di crescita difasica o diauxica , la cui velocità può anche essere diversa. Nota: Può capitare che durante la costruzione di una curva di crescita, si fanno prelievi troppo distanti tra di loro, ad esempio, il tempo 0 e poi il tempo 1 dopo quattro ore. Così si vede una curva piatta. Magari se si prendeva a 2 ore si vedeva la fase di adattamento. Gli intervalli di tempo in cui facciamo i prelievi, a parte E. coli che si divide ogni 20 minuti, gli altri batteri sono più lenti quindi di solito si prendono ogni ora, oppure ogni due ore. Per cui se si fa il prelievo ad esempio ogni 24 ore ci si può non accorgere di certe fasi. Mentre altri microrganismi hanno tempi di crescita diversi ad esempio con gli Streptomiceti si prendono anche ogni 12 ore o 24 ore. 0 1 2 3 4 T e m p o ( o r e ) e s a u r i m e n t o d e l g l u c o s i o i n d u z i o n e b g a l a t t o s i d a s i Densità batterica
Sincronizzazione
Quando dobbiamo costruire la curva di crescita, dobbiamo metterci nelle condizioni in cui i batteri siano su per giù nella stessa fase di crescita, quindi, per fare questo, esistono vari metodi in base al microganismo. Un esempio è un metodo che agisce sul metabolismo cellulare: portando tutte le cellule della popolazione allo stesso punto del ciclo di divisione. Ovvero prima si fa l'inoculo da piastra, prendendo l'ansata e mettendola nel tubo. Dopo averlo fatto crescere tutta la notte, senza prendere nessun punto, si sa che il giorno dopo si avrà una coltura di Escherichia coli ricca in fase stazionaria, in cui tutte le cellule si trovano nella stessa fase e questo verrà utilizzato come inoculo per andare a valutare come cresce la popolazione batterica. Quindi si faranno due inoculi, il primo da piastra che ci servirà come pre inoculo, come preparazione della coltura e il secondo, che si farà dal primo inoculo, di cui andremo a valutare la crescita nel tempo, partendo dal presupposto che quando prendiamo le cellule provenienti dal primo inoculo queste sono su per giù tutte nella stessa fase metabolica. Ci sono dei sistemi in cui fare la sincronizzazione è facile, ad esempio come nel caso di batteri che fanno le spore. Se si vuole inoculare Streptomyces coelicolor e si vuole studiare la popolazione, essendo sicuri che tutti siano nella stessa fase di crescita, bisogna preparare le spore che si mettono nel terreno di coltura e queste, germinando, sono tutte coordinate tra di loro su per giù. Con altri batteri si usano metodi fisici:
- Per filtrazione : si separano i batteri in base alla loro grandezza usando dei filtri, in quanto i batteri che si stanno dividendo sono volumetricamente più grandi, così si separano le cellule che non si dividono da quelle che si dividono;
- Mediante illuminazione : ci sono dei batteri in cui la divisione dipende dalla luce. Quindi si gioca somministrando luce o meno;
- Per sbalzi termici , si usa con Pneumococchi e Salmonella;
- per centrifugazione;
- Per affamamento. Questa immagine (a destra) è una curva di crescita bifasica, in cui c'è la percentuale dei batteri, (non ci dice qual è l'unità di misura che sta usando), e fa vedere però che c'è una prima fase di crescita, una fase di adattamento e una seconda fase di crescita. In questo caso sarebbe l'uso del glucosio e del lattosio. Oppure abbiamo una fase di crescita simile a quella bifasica che è quella degli Streptomiceti, che sono dei batteri filamentosi, nei quali si assiste ad una cosa del genere: c'è scritto RG1 al posto di esponenziale, “ T ” “ fase di transizione” al posto di adattamento, c'è scritto RG2 e poi “ S stazionaria. Questi batteri fanno i metaboliti secondari: ad un certo punto smettono di fare la crescita del micelio vegetativo ed iniziano a fare il micelio aereo. In terreno liquido non si assiste alla formazione delle spore, ma soltanto in alcuni microrganismi si riescono a formare le spore. Inoltre non si parla più di crescita esponenziale perchè, mentre in Escherichia coli da una cellula se ne formano due, questi sono batteri filmanetosi, quindi è difficile parlare di esponenziale, ma si parla di fase di crescita rapida (RG), perchè è la fase di allungamento del filamento. Si parla di fase di crescita rapida 1 e 2, intervallate da una fase di transizione, che corrisponde nel terreno solido a quando smettono di crescere verso il basso, smettono di fare il micelio vegetativo e iniziano a salire verso l'altro, a fare il micelio aereo. E' la parte in cui cominciano a produrre metaboliti secondari. La fase di transizione , non è una fase di stallo, ma è una fase di morte: i batteri in questa fase, vanno in lisi e i pochi superstiti che rimangono si reinventano, degradano un po' di tutto quello che c'è dentro la cellula, per cui si hanno delle fasi di transizioni molto spinte. Siccome sono batteri che crescono per tanto tempo, molto spesso capita che alcuni vanno in lisi, liberano nutrienti e ricominciano a crescere. Per cui in alcuni terreni si assiste a delle curve che salgono e scendono varie volte. In questo caso abbiamo RG1, RG2, intervallata dalla transizione che è una diminuzione delle sintesi delle
che è intercorso tra queste due misurazioni del numero di batteri rispetto al numero di generazioni che abbiamo misurato in questa maniera. Così riusciamo ad ottenere la velocità di crescita , che è data dal numero di generazioni rispetto al tempo. Per calcolare queste cose bisogna lavorare con delle curve che siano semilogaritmiche, che danno l'andamento di una retta, perchè quello che dobbiamo considerare sono due punti all'interno della fase di crescita esponenziale. Non si può andare a misurare la velocità di crescita nella fase di adattamento o nella fase stazionaria, ma nel momento che i batteri crescono al massimo delle loro possibilità in quel frangente, e tutti nella stessa maniera. Ci si è accorti che, affinché il genoma sia replicato, in quella che viene chiamata fase C, in E. coli ci vogliono 40 minuti; affinchè la cellula setti, (fase D), ci vogliono altri 20 minuti, per cui affinchè E. coli, al massimo delle sue condizioni, si possa dividere, ci vorrebbero 60 minuti. Quando invece si va a misurare la velocità di crescita di E. coli in laboratorio si trova che il tempo è di 20 minuti quando è in esponenziale, le condizioni sono quelle massime, ecc. Questo perchè, quello che succede, è che man mano che la cellula si replica, non è così veloce a settarsi, per cui noi abbiamo dei momenti in cui la cellula appare polidiploide, cioè sono ammassi più grandi con più centri di replicazione, con più origini di replicazione che sono partite. Fattori ambientali che influenzano la crescita Quali sono i fattori ambientali che possono influenzare la crescita?
- la temperatura : i batteri si dividono in psicrofili , mesofili e termofili ;
- il pH : acidofili o basofili ; anche se all'interno nel citoplasma hanno tutti pH circa neutro;
- l'Ossigeno. In base al rapporto che i microrganismi hanno con l'ossigeno, distinguiamo cinque gruppi: aerobi obbligati , che sono quelli alla quale se gli leviamo l'ossigeno muoiono e sanno fare respirazione aerobia; aerobi facoltativi , come Escherichia coli, che sa fare la respirazione, la fermentazione, sa usare l'ossigeno e può anche non usarlo; gli anaerobi obbligati , che sono quelli che non fanno la respirazione aerobia, ma fanno solo respirazione anaerobia o fermentazione; i microaerofili , che fanno respirazione aerobia ma hanno bisogno di crescere in percentuale di ossigeno inferiore al 20% quindi hanno bisogno di poco ossigeno; gli aerotolleranti , che sono degli anaerobi a cui l'ossigeno non fa male. Non lo usano, ma non vengono uccisi da esso.
- Rispetto alla pressione osmotica o alla salinità , ad esempio Streptococcus aureus, che cresce su un terreno che si chiama MSA : mannitolo, sale, agar. Non è un alofilo vero e proprio, ma è considerato un alotollerante, ma bisogna considerare che ci sono ambienti più salini e ambienti meno salini, come l'acqua dei laghi o l'acqua del mare, ci sono batteri che vivono in uno o nell'altro, perchè hanno un modo diverso di relazionarsi con un ambiente salino. Noi siamo abituati al fatto che fuori ci sia più un ambiente con poco sale, infatti abbiamo studiato il peptidoglicano che serve ad impedire l'ingresso, perchè dentro la cellula ci sono troppi soluti, quindi dentro c'è sempre l'acqua. Invece qua siamo nella condizione opposta.
- O la pressione idrostatica quindi barotolleranti o baroresistenti , cioè batteri che crescono a pressioni elevate. Temperatura Quando si parla delle temperature, si dividono in psicrofili, mesofili e termofili. Sono tre grandi classi in cui noi abbiamo distinto i microrganismi in base alle temperature di crescita a cui possono vivere. Le tre temperature, dette temperature cardinali, per ogni microrganismo sono: la temperatura minima, quella ottimale e quella massima.
La curva di temperatura non è una curva di crescita: in ordinata c'è il tasso di crescita, quindi per trovarla hanno fatto moltissime curve di crescita, una per ogni temperatura e sono andate a misurare con la formula di prima, la velocità di crescita, inoculando lo stesso quantitativo di microrganismi, mettendo lo stesso terreno, con l'unica variabile che è la temperatura. Quindi hanno incubato, ad esempio, una beuta a 20°, un'altra a 24°, una 28°, una a 32°, ecc. si sono fatti le curve di crescita per ogni temperatura. Sono andati a misurare la velocità di crescita, e in questo grafico riportano la velocità di crescita rispetto alla temperatura. Quindi non c'entra niente con la curva di crescita, perchè in quest'ultima c'è un parametro che indica la crescita rispetto al tempo. Se non si sa a che temperatura cresce un microrganismo, si può avere un'idea: se lo si prende dall'Antartide si andranno a valutare le temperature basse, se lo si prende dai Tropici, si andranno a valutare le temperature alte; se lo si prende da un paziente si considerano più temperature intorno a 37°, ad esempio si parte da 15° fino a 60°. Quando si fanno varie curve, con tutti i valori uguali, a parte la temperatura, si va a misurare la velocità di crescita e la si misura. Così si assiste che ogni specie batterica è caratterizzata da tre temperature:
- la temperatura minima che è la minima temperatura a cui un batterio si divide, ma molto lentamente. E' la minima velcoità di crescita. Un grado sotto non si divide.
- La temperatura massima è quella al di sopra della quale non riesce a crescere, perchè si denaturano le proteine, si denatura il DNA o si rompono le membrane, ma al di sotto di questa temperatura massima cresce un po' più lentamente.
- Una temperatura ottimale in cui si ha la velocità di crescita più veloce. Dipende dal gruppo abbiamo gli psicrofili, i mesofili, termofili, ipertermofili, ipertermofili estremi, con batteri che hanno un optimum a 4°, 40°, 60°, 88° e 106°. Il fatto che un batterio cresce a 37°, non vuol dire che mettendolo a 34° non cresce, semplicemente è più lento a crescere. Se si ripone un alimento in frigo contaminato si riduce la velocità di crescita del microorganismo, non si elimina.
