Biochemia - cukry: całość przedmiotu, Skrypty z Inżynieria biochemiczna

Pobierz Biochemia - cukry: całość przedmiotu i więcej Skrypty w PDF z Inżynieria biochemiczna tylko na Docsity! Laboratorium z biochemii DLA STUDENTÓW BIOLOGII, BIOTECHNOLOGII I OCHRONY ŚRODOWISKA Praca zbiorowa pod redakcją Antoniego Polanowskiego Poprawki do wydania III wprowadzone pod redakcją Justyny Ciuraszkiewicz i Elżbiety Gocek 5. CUKRY Autorzy: Teresa Olczak, Zdzisław Wróblewski (ed. Justyna Ciuraszkiewicz) 5.1 Monosacharydy 2 5.1.1 Wpływ zasad na cukry 4 5.1.2 Wpływ stężonych kwasów na cukry 4 5.1.3 Odczyny wspólne dla wszystkich cukrów 5 5.1.3.1 Odczyn Molischa z α-naftolem 5 5.1.4 Wykrywanie ketoz – próba Seliwanowa z rezorcyną 6 5.1.5 Wykrywanie pentoz 7 5.1.5.1 Próba Biala na pentozy 7 5.1.5.2 Próba Dischego na deoksyrybozę 7 5.1.6 Właściwości redukujące cukrów 8 5.1.6.1 Próba Trommera 8 5.1.6.2 Próba Benedicta 8 5.2 Oligosacharydy 9 5.2.1 Wpływ rozcieńczonych kwasów na oligosacharydy 10 5.2.2 Odróżnianie monosacharydów od disacharydów 10 5.2.2.1 Próba Barfoeda 10 5.3 Polisacharydy 11 5.3.1 Próba jodowa 11 5.3.2 Kwaśna hydroliza polisacharydów 12 5.3.3 Enzymatyczna hydroliza polisacharydów 12 5.3.4 Oznaczanie cukrów redukujących metodą Bernfelda 13 5.4. Ilościowe oznaczanie cukrów 14 5.4.1 Oznaczanie glukozy metodą enzymatyczną 14 5.4.2 Oznaczanie cukrów mikrometodą fenolową 15 5.4.3 Oznaczanie kwasu sjalowego zmodyfikowaną metodą rezorcynolową 17 2 5.1. MONOSACHARYDY Cukry proste (monosacharydy) klasyfikuje się wg grup funkcyjnych (aldozy, ketozy) i ilości atomów węgla w cząsteczce (triozy, tetrozy, pentozy, heksozy, itd.). Najprostsze monosacharydy to trójwęglowe triozy: aldehyd glicerynowy (aldoza) i dihydroksyaceton (ketoza) (Rys. 5.1). Rys.5.1. Przykłady prostych monosacharydów Aldehyd glicerynowy posiada jeden asymetryczny atom węgla i dlatego występuje w postaci dwóch izomerów przestrzennych: D i L. Do szeregu konfiguracyjnego D zalicza się te cukry, które w formie łańcuchowej (przedstawionej wzorami rzutowymi Fischera) przy węglu asymetrycznym o najwyższej numeracji (przy przedostatnim licząc od grupy aldehydowej lub ketonowej) mają po prawej stronie grupę hydroksylową. Jeśli grupa ta znajduje się po lewej stronie, związek taki należy do szeregu L. Trzy podstawowe aldoheksozy (glukoza, galaktoza i mannoza) posiadają cztery asymetryczne atomy węgla i dlatego całkowita ilość stereoizomerów wynosi 2 4 , czyli 16. Związki takie wykazują aktywność optyczną, która umożliwia skręcanie płaszczyzny światła spolaryzowanego. Monosacharydy zawierające cztery lub więcej atomów węgla w cząsteczce, występują w postaci pierścieniowych odmian tautomerycznych, tworzących się w wyniku powstawania wewnątrzcząsteczkowych wiązań półacetalowych (Rys. 5.2). Formy otwartego łańcucha w roztworach ulegają cyklizacji, tworząc struktury pierścieniowe i zarówno w stanie stałym jak i w roztworze, nie zawierają one wolnej grupy aldehydowej lub ketonowej. Rotacja wokół wiązania między C-4 i C-5 D-glukozy przenosi grupę hydroksylową C-5 do grupy aldehydowej C-1, co powoduje utworzenie cyklicznego półacetalu. Forma otwartego łańcucha glukozy i innych aldoheksoz w roztworach wodnych istnieje tylko w bardzo małych ilościach (<1%). Reakcja grupy hydroksylowej C-5 z grupą karbonylową C-2 daje cykliczny półketal. Niezależnie od konfiguracji przy pozostałych asymetrycznych atomach węgla, która w formie pierścieniowej jest taka sama jak w łańcuchowej, możliwe są dwie formy pierścieniowe każdego monosacharydu, różniące się położeniem grupy –OH przy półacetalowym atomie węgla (w formie łańcuchowej węgiel ten nie jest asymetryczny). Zjawisko istnienia dwóch odmian tej samej cyklicznej postaci monosacharydu, różniących się tylko orientacją przestrzenną pierwszego atomu węgla w cząsteczce aldoz lub drugiego atomu węgla w cząsteczce ketoz, nosi nazwę anomerii. Takie odmiany związków nazywa się anomerami, a atomy węgla, warunkujące występowanie tej odmiany izomerii, atomami anomerycznymi. Formy α i β różnią się od siebie przede wszystkim skręcalnością optyczną. Każdy z dwóch trwałych w stanie krystalicznym anomerów w roztworze przechodzi w równowagową mieszaninę obu tych odmian. α-D-glukopiranoza o skręcalności właściwej [α]D = +112º, a β-D-glukopiranoza o skręcalności właściwej [α]D=+19º, w roztworze osiągają stan równowagi, aż do uzyskania skręcalności właściwej [α]D=+52º. 5 Rys. 5.4. Reakcja odwodnienia pentoz i heksoz 5.1.3. Odczyny wspólne dla wszystkich cukrów 5.1.3.1. Próba Molischa z α-naftolem Zasada metody Dodatnią próbę Molischa wykazują wszystkie cukry, a także aldehydy, aceton i kwasy organiczne. W obecności stężonego kwasu siarkowego dochodzi do odwodnienia cukrów i powstaje furfural lub 5-hydroksymetylofurfural, które z α-naftolem tworzą barwne kompleksy (Rys. 5.5). Ujemna próba Molischa wyklucza obecność cukru. Postępowanie 1. Do 2 ml badanego roztworu dodać dwie krople odczynnika Molischa zawierającego α-naftol, zmieszać i ostrożnie podwarstwić 1 ml stężonego kwasu siarkowego. 2. Na granicy faz powstaje czerwono-fioletowy krążek. Materiały i odczynniki − 1% roztwór glukozy, fruktozy, sacharozy − 0,1% roztwór skrobi i glikogenu − odczynnik Molischa: 10% α-naftol − stężony kwas siarkowy (VI) 6 Rys. 5.5. Reakcja Molischa 5.1.4. Wykrywanie ketoz - próba Seliwanowa z rezorcyną Zasada metody Dodatni odczyn Seliwanowa wykazują ketozy. Po odwodnieniu tych cukrów w obecności stężonego kwasu solnego powstaje furfural lub 5-hydroksymetylofurfural, które z rezorcyną tworzą barwne kompleksy (Rys. 5.6). Rys.5.6. Reakcja Seliwanowa. 7 Postępowanie 1. Do 1 ml odczynnika Seliwanowa dodać kroplę roztworu fruktozy. Zmieszać i wstawić do wrzącej łaźni wodnej dokładnie na 30 sek. 2. Wyjąć i oziębić. Próba przyjmuje czerwone zabarwienie. 3. Próbę powtórzyć na innych cukrach. Inne cukry dają dodatni odczyn Seliwanowa po dłuższym ogrzewaniu. Materiały i odczynniki − 1% roztwór glukozy, fruktozy i sacharozy − 0,1% roztwór skrobi, glikogenu − odczynnik Seliwanowa: stężony kwas solny rozcieńczyć dwa razy wodą i rozpuścić w nim rezorcynę do uzyskania roztworu o stężeniu 0,05% 5.1.5. Wykrywanie pentoz 5.1.5.1. Próba Biala na pentozy Zasada metody Wolne pentozy, ich estry fosforanowe oraz ryboza związana w nukleozydach i nukleotydach purynowych ogrzewane ze stężonym kwasem solnym odwadniają się do furfuralu, który z orcyną i jonami Fe 3+ daje zielono zabarwiony kompleks. Deoksyryboza oraz ryboza związana z zasadami pirymidynowymi dają bardzo słaby odczyn. Postępowanie 1. Do probówki dodać 1 ml roztworu rybozy oraz 1 ml odczynnika Biala, zamieszać i wstawić do wrzącej łaźni wodnej na okres 20 minut. 2. Próbę powtórzyć na roztworach RNA i DNA. 3. Opisać wynik. Materiały i odczynniki − 0,01% roztwór rybozy − 0,05% roztwory RNA i DNA − odczynnik Biala: w 100 ml stężonego kwasu solnego rozpuścić 0,5 g orcyny i dodać kilka kropel 10% roztworu chlorku żelaza (III) 5.1.5.2. Próba Dischego na deoksyrybozę Zasada metody Deoksyryboza ogrzewana w środowisku silnie kwaśnym odwadnia się do furfuralu, który tworzy niebieski kompleks z difenyloaminą. Ryboza i inne pentozy nie dają tego odczynu. Postępowanie 1. Do probówki dodać 1 ml DNA oraz 1 ml odczynnika Dischego, zamieszać i wstawić na okres 10 minut do wrzącej łaźni wodnej. 2. Próbę powtórzyć na roztworze RNA. Porównać uzyskane wyniki. 10 5.2.1. Wpływ rozcieńczonych kwasów na oligosacharydy Zasada metody Wszystkie disacharydy łatwo ulegają kwaśnej hydrolizie, co świadczy o obecności w nich wiązań glikozydowych. Hydroliza wiązań glikozydowych (włączanie cząsteczki wody) przebiega w środowisku kwaśnym. Oligosacharydy hydrolizują już w obecności słabych kwasów (0,5–1 M). Pękają wówczas wiązania glikozydowe z uwolnieniem monosacharydów. Sacharoza hydrolizuje bardzo łatwo już w temp. pokojowej w obecności 0,1 M kwasu solnego. W przypadku sacharozy zachodzi specyficzne zjawisko zwane inwersją. Po rozpuszczeniu i hydrolizie sacharozy wykazującej skręcalność właściwą [α]D=+67º, otrzymuje się lewoskrętną mieszaninę D-glukozy i D-fruktozy. Postępowanie 1. Do 5 ml 1% roztworu sacharozy dodać równą objętość 0,1 M kwasu solnego i wstawić na 15 minut do wrzącej łaźni wodnej. 2. Wykonać próbę redukcyjną przed i po hydrolizie. Materiały i odczynniki − 1% roztwór sacharozy − 0,1 M kwas solny − 2 M wodorotlenek sodu − 0,25 M siarczan (VI) miedzi (II) 5.2.2. Odróżnianie monosacharydów od disacharydów 5.2.2.1. Próba Barfoeda Zasada metody Próba ta pozwala na odróżnienie monosacharydów od disacharydów redukujących na podstawie reakcji redukcji w środowisku lekko kwaśnym. Monosacharydy łatwo wykazują właściwości redukujące natomiast disacharydy dopiero po dłuższym ogrzewaniu, gdy zostanie rozerwane wiązanie glikozydowe. Postępowanie 1. Do 1 ml odczynnika Barfoeda dodać 1 ml roztworu cukru i po wymieszaniu wstawić do łaźni wodnej na 3 min. 2. Pojawia się czerwony osad tlenku miedziawego (Cu2O) w probówce z monosacharydem, a w probówkach z disacharydami dopiero po ogrzewaniu kilkunastominutowym. Materiały i odczynniki − odczynnik Barfoeda: 13,3 g octanu miedzi rozpuścić w 200 ml wody, przesączyć i dodać 1,8 ml kwasu octowego lodowatego 11 5.3. POLISACHARYDY Polisacharydy, inaczej cukry złożone, to liniowe lub rozgałęzione polimery o dużej masie cząsteczkowej, zbudowane z podjednostek – monosacharydów. Strukturę liniową wykazuje amyloza wchodząca w skład skrobi (wiązania α-1,4-glikozydowe) i celuloza (wiązania β-1,4-glikozydowe), a strukturę rozgałęzioną amylopektyna, wchodząca w skład skrobi i glikogen (wiązania α-1,4 i α-1,6-glikozydowe). W glikogenie wiązania α-1,6-glikozydowe występują co 6-10 reszt glukozowych, a w skrobi co 25 reszt glukozowych, powodując, że glikogen jest polisacharydem o strukturze bardziej rozgałęzionej w porównaniu ze skrobią (Rys. 5.8). Polisacharydy dają pozytywny odczyn w reakcji z jodem (rozdział 5.3.1). Rys. 5.8. Podstawowe wiązania glikozydowe łączące monomery cukrów w polisacharydach 5.3.1. Próba jodowa Zasada metody Zabarwienie skrobi pod wpływem jodu spowodowane jest adsorpcją jodu na cząsteczce polisacharydu. Adsorpcja ma charakter kanałowy, tzn. cząsteczki jodu wchodzą do kanału utworzonego przez spiralnie skręcone łańcuchy skrobi. Cząsteczki jodu w obrębie spirali skrobi tworzą prosty łańcuch, wzdłuż którego mogą przemieszczać się elektrony, co powoduje pochłanianie światła przez cały kompleks. Barwa zależy od długości łańcucha. Amyloza daje zabarwienie niebieskie, amylopektyna fioletowo-czerwone. W obecności zasad zabarwienie nie powstaje, gdyż jod reaguje z jonem wodorotlenowym. Postępowanie 1. Do 2 ml słabo kwaśnego roztworu skrobi dodać 1 kroplę 0,01 M roztworu jodu w 1% jodku potasu. Próbę powtórzyć na roztworze glikogenu. 2. Probówki, w których powstała niebieska barwa z jodem, ogrzać we wrzącej łaźni wodnej, a następnie oziębić pod bieżącą wodą. 3. Próbę powtórzyć używając zasadowego roztworu skrobi oraz skrobi, do której uprzednio dodano etanol i NaOH. 12 Materiały i odczynniki − 0,1% roztwór skrobi, glikogenu − 0,01 M jod w 1% jodku potasu − 2 M chlorek sodu − etanol − 1 M wodorotlenek sodu 5.3.2. Kwaśna hydroliza polisacharydów Zasada metody Stopniowa hydroliza skrobi zachodzi pod wpływem rozcieńczonych kwasów. Pękają wówczas wiązania glikozydowe z przyłączeniem cząsteczki wody. Początkowo powstają dekstryny, następnie maltoza i ostatecznie glukoza. Rozrywanie wiązań glikozydowych powoduje wzrost właściwości redukujących hydrolizatu, gdyż uwalnia się grupa aldehydowa. Powoduje to zanik reakcji z jodem. Całkowita hydroliza polisacharydów wymaga dłuższego ogrzewania w obecności silnych kwasów (1–2 M kwas solny lub siarkowy (VI)) w temp. wrzenia. Postępowanie 1. Do probówki odmierzyć 5 ml roztworu skrobi i dodać 2 ml 2 M kwasu solnego. Zmieszać i wstawić do wrzącej łaźni wodnej. Co 3 minuty pobierać kroplę roztworu i na płytce porcelanowej wykonywać reakcję z jodem. Zakończyć hydrolizę, gdy barwa jodu nie ulega zmianie. Barwę jodu porównywać z barwą próby kontrolnej (kropla wody i kropla roztworu jodu) oraz z barwą próby zerowej (przed hydrolizą). Po oziębieniu próbę zobojętnić i wykonać próbę na cukry redukujące. 2. Powtórzyć doświadczenie stosując roztwór glikogenu. 3. Skrawki bibuły umieścić w probówce, dodać 10 ml wody i 1 ml stężonego kwasu siarkowego. Wstawić na 20 minut do wrzącej łaźni wodnej. Po zobojętnieniu wykonać próbę redukcyjną na cukry (doświadczenie 5.1.6). Materiały i odczynniki − 1% roztwór skrobi, glikogenu − bibuła − 2 M kwas solny − 2 M wodorotlenek sodu − stężony kwas siarkowy (VI) − 0,01 M jod w 1% jodku potasu − odczynniki potrzebne w próbach redukujących cukrów 5.3.3. Enzymatyczna hydroliza polisacharydów Zasada metody Hydroliza enzymatyczna skrobi i glikogenu zachodzi pod wpływem enzymów amylaz. α-amylazy (E.C.3.2.1) są endoglukozydazami hydrolizującymi wiązania α-1,4-glikozydowe położone wewnątrz cząsteczki polisacharydu. Pierwszym produktem tej reakcji są erytrodekstryny dające z jodem zabarwienie czerwono-fioletowe. Następnie powstają niskie 15 peroksydazy (POD). Natężenie powstałego zabarwienia jest proporcjonalne do stężenia glukozy w badanej próbce. Metoda ta jest swoista dla glukozy w pierwszym etapie. Drugi etap stwarza możliwość wielorakich interakcji. Wszystkie substancje podlegające łatwo reakcjom red–oks, występujące we krwi (glutation, kwas askorbinowy, kwas moczowy, bilirubina) lub wprowadzone do organizmu (niektóre leki – kwas acetylosalicylowy, penicyliny, tetracykliny) oraz składniki patologiczne (kwas acetooctowy), łatwo reagują z nadtlenkiem wodoru i zmniejszają wynik reakcji w sposób nieswoisty. Ponadto krew, nawet po odbiałczeniu, może zawierać czynniki (porfiryny, jony żelaza) działające podobnie do peroksydazy. Utrzymanie stałego stężenia glukozy we krwi jest wynikiem działania mechanizmów regulujących i równowagi pomiędzy katabolizmem i anabolizmem glukozy, a nadrzędną rolę pełnią czynniki hormonalne. Hyperglikemia – wzrost stężenia glukozy we krwi – występuje fizjologicznie w 30–60 minucie po posiłku. W stanach patologicznych może być spowodowana: a) zmniejszonym zużyciem glukozy w tkankach (cukrzyca), b) zwiększonym rozpadem glikogenu w wątrobie (nadczynność tarczycy), c) zwiększoną glukoneogenezą. Zwiększenie stężenia glukozy we krwi powyżej 160 mg/dl (8,88 mmol/l) prowadzi do przekroczenia progu nerkowego, co powoduje glukozurię, czyli utratę glukozy z moczem. Hypoglikemia – zmniejszenie stężenia glukozy we krwi – może być spowodowana: a) wyczerpaniem rezerw glikogenu w wątrobie (niewydolność wątroby) lub utratą zdolności do rozkładu glikogenu (choroba spichrzeniowa – brak fosfatazy G-6-P), b) zwiększonym zużyciem glukozy w tkankach (nadmiar insuliny), c) zużyciem glukozy do syntezy laktozy w okresie laktacji. Wartości prawidłowe: − krew: 60 –100 mg/dl (3,36 – 5,6 mmol/l) − osocze: 70 –110 mg/dl (3,92 – 6,16 mmol/l) − płyn mózgowo-rdzeniowy: 45 – 70 mg/dl (2,52 – 3,92 mmol/l) Postępowanie Wykonanie doświadczenia zgodnie z protokołem. 5.4.2. Oznaczanie cukrów mikrometodą fenolową Dubois M., Gilles K.H., Hamilton J.K., Rebers P.H., Smith F. (1956) Anal. Chem. 28, 350– 356. Zasada metody Cukry proste, oligosacharydy oraz polisacharydy ulegają odwodnieniu pod wpływem stężonego kwasu siarkowego. Z pentoz powstaje furfural, a z heksoz oksymetylenofurfural. Związki te w obecności fenolu i stężonego kwasu siarkowego tworzą kompleks o zabarwieniu pomarańczowym. Reakcja jest czuła, a barwa trwała. Mikrometoda ta jest szczególnie dobra do oznaczania małych ilości cukrów, rozdzielonych metodą chromatograficzną z użyciem układu fenol : woda oraz układów lotnych (np. etanol : woda). 16 Postępowanie 1. Przy oznaczaniu cukrów związanych w glikoproteinach, przed przeprowadzeniem reakcji barwnej najpierw należy przeprowadzić hydrolizę białek w celu uwolnienia reszt cukrowych. W tym celu należy zmieszać 0,1 ml roztworu zawierającego glikoproteinę z 0,1 ml 0,1 M kwasu siarkowego (VI) i ogrzewać przez 60 minut w temp. 80°C. Po zakończeniu inkubacji probówkę zawierającą próbę badaną ochłodzić. 2. Do oznakowanych probówek dodać podane w tabeli niżej odczynniki i dokładnie wymieszać (Uwaga! stężony kwas pipetować pod wyciągiem używając szklanej pipety zaopatrzonej w specjalną nasadkę). Roztwór badany i wzorcowy powinny zawierać 4–16 µg cukru w 0,2 ml. składnik próba badana próba wzorcowa próba odczynnikowa materiał badany 0,2 ml – – wzorzec – 0,2 ml – woda destylowana – – 0,2 ml 5% fenol 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml stężony kwas siarkowy (VI) 1 ml 1 ml 1 ml 3. Próby pozostawić na 30 minut w temperaturze pokojowej. 4. Odczytać absorbancję prób badanych i wzorcowych wobec próby odczynnikowej przy długości fali 490 nm, w kuwecie o grubości 1 cm. 5. Stężenie cukru obliczyć z poniższego wzoru: gdzie: Cb – stężenie próby badanej, Ab – absorbancja próby badanej, Cwz – stężenie wzorca, Awz – absorbancja wzorca. Materiały i odczynniki − wzorzec – stabilizowany 0,05% lub 0,001% roztwór glukozy: 2,5 g kwasu benzoesowego rozpuścić w 1 l wrzącej wody i ochłodzić; odważyć 0,05 g lub 0,001 g glukozy i rozpuścić w 100 ml nasyconego roztworu kwasu benzoesowego − 5% roztwór fenolu − stężony kwas siarkowy (VI) − 0,1 M kwas siarkowy (VI) 17 5.4.3. Oznaczanie kwasu sjalowego zmodyfikowaną metodą rezorcynolową Jourdian G.W., Dean L., Roseman S. (1971) J. Biol. Chem. 246, 430-435. Zasada metody Metoda ta polega na tworzeniu barwnych związków z rezorcynolem przez pochodne kwasu sjalowego powstające po odwodnieniu przez stężone kwasy. Modyfikacja polegająca na utlenianiu kwasu sjalowego kwasem jodowym (VII) (nadjodowy) powoduje, że jest to metoda czuła i specyficzna, gdyż w reakcji tej nie biorą udziału inne związki, takie jak lipidy, aminokwasy i pozostałe cukry. Dodatkowo, metodą tą można oznaczać kwas sjalowy związany glikozydowo bez uprzedniej hydrolizy glikoprotein. Kwas sjalowy związany glikozydowo tworzy barwny kompleks trwały w temp. 37°C, podczas gdy barwny kompleks powstający z wolnego kwasu sjalowego jest rozkładany w tej temp., ale trwały w temp. 0°C. W ten sposób można oznaczyć kwas sjalowy całkowity, wolny i związany glikozydowo. Postępowanie 1. Do roztworu badanego lub wzorcowego (zawierającego nie więcej niż 0,2 µmole kwasu sjalowego w całkowitej objętości 250 µl) dodać 50 µl 0,04 M kwasu nadjodowego. 2. Wymieszać ostrożnie i w zależności od rodzaju badanego kwasu sjalowego inkubować: − na lodzie przez 35 minut (całkowity kwas sjalowy) − na lodzie 20 minut (wolny kwas sjalowy) − w temp. 37°C przez 60 minut (kwas sjalowy związany glikozydowo) 3. Dodać 625 µl odczynnika rezorcynolowego, wymieszać i pozostawić na lodzie przez 5 minut, a następnie ogrzewać przez 15 minut w temp. 100°C. 4. Ochłodzić pod bieżącą wodą i dodać 625 µl alkoholu tert-butylowego i dobrze wymieszać. 5. Wstawić do łaźni wodnej o temp. 37°C w celu stabilizacji barwy, a następnie ochłodzić do temp. pokojowej. 6. Odczytać absorbancję przy długości fali 630 nm (barwa jest trwała w temp. pokojowej – po 24 godz. wartość absorbancji obniża się o 10-20%). Wartość absorbancji jest proporcjonalna do stężenia kwasu sjalowego w zakresie 0,012-0,2 µmole kwasu sjalowego. 7. Zawartość kwasu sjalowego obliczyć ze wzoru lub sporządzić krzywą standardową w zakresie od 0,012-0,2 µmole kwasu sjalowego w próbie o objętości 250 µl. Materiały i odczynniki − 0,04 M kwas jodowy (VII) (nadjodowy): odważyć 0,45 g kwasu nadjodowego i rozpuścić w 100 ml wody destylowanej − odczynnik rezorcynolowy: 0,6 g rezorcynolu rozpuścić w roztworze zawierającym 60 ml 28% HCl, 1 ml 25 mM CuSO4 (0,4 g bezwodnego CuSO4 rozpuścić w 100 ml wody destylowanej) i 39 ml wody destylowanej − 95% alkohol tert-butylowy − roztwór wzorcowy kwasu sjalowego o stężeniu 20 µmoli/10 ml: odważyć 6,2 mg kwasu sjalowego i rozpuścić w 10 ml wody destylowanej