Dariusz Latowski
El bieta Jarosz-Krzemi ska
Anna Kostka
MATERIA Y DO WICZE LABORATORYJNYCH
Z BIOCHEMII
dla studentów Ochrony rodowiska na AGH
UNIA EUROPEJSKA
EUROPEJSKI
FUNDUSZ SPOŁECZNY
Przygotuj się do egzaminów
Studiuj dzięki licznym zasobom udostępnionym na Docsity
Otrzymaj punkty, aby pobrać
Zdobywaj punkty, pomagając innym studentom lub wykup je w ramach planu Premium
Informacje i wskazówki
Przygotuj się do egzaminów
Studiuj dzięki licznym zasobom udostępnionym na Docsity
Otrzymaj punkty, aby pobrać
Zdobywaj punkty, pomagając innym studentom lub wykup je w ramach planu Premium
Społeczność
Ranking uczelni
Odkryj najlepsze uniwersytety w twoim kraju, według użytkowników Docsity
Bezpłatne poradniki
Nasze e-booki ratujące uczniów i studentów!
Pobierz bezpłatnie nasze przewodniki na temat technik studiowania, metod panowania nad stresem, wskazówki do przygotowania do prac magisterskich opracowane przez wykładowców Docsity
Biochemia - materiały do ćwiczeń, Laboratoria z Inżynieria biochemiczna
Opracowanie dla studentów Ochrony Środowiska
Typologia: Laboratoria
2019/2020
1 / 27
Ta strona nie jest widoczna w podglądzie
Nie przegap ważnych części!
Dokumenty powiązane
Podgląd częściowego tekstu
Pobierz Biochemia - materiały do ćwiczeń i więcej Laboratoria w PDF z Inżynieria biochemiczna tylko na Docsity!
Dariusz Latowski
El bieta Jarosz-Krzemi ska
Anna Kostka
MATERIA Y DO WICZE LABORATORYJNYCH Z BIOCHEMII dla studentów Ochrony rodowiska na AGH UNIA EUROPEJSKA EUROPEJSKI FUNDUSZ SPOŁECZNY
ROZDZIAŁ PIERWSZY:
OBLICZENIA BIOCHEMICZNE
Roztworem nazywamy mieszaninę co najmniej 2 składników, które przez dłuższy czas nie ulegają rozdzieleniu. Jedna z substancji w roztworze pełni funkcje rozpuszczalnika, druga jest substancją rozpuszczoną. Pojęciem stężenia roztworu określa się ilość substancji rozpuszczonej w określonej jednostce objętości lub masy roztworu. W laboratorium biochemicznym najczęściej stężenia roztworów wyrażane się w stężeniach procentowych (%) lub molowych (mol/dm^3 ). Stężenia procentowe to liczba części rozpuszczonej substancji na 100 części roztworu. W zależności od tego o jakim rodzaju części mowa stężenie procentowe można wyrazić na 3 sposoby:
- stężenie procentowe wagowo-wagowe ( % w/w lub m/m ), czyli liczba części masowych substancji rozpuszczonej w 100 tych samych częściach masowych roztworu, np. liczba gramów substancji rozpuszczonej w 100 g roztworu;
- stężenie procentowe wagowo-objętościowe ( % w/v lub m/v ), czyli liczbę części masowych substancji rozpuszczonej w 100 częściach objętościowych roztworu, np. liczba gramów substancji rozpuszczonej w 100 ml roztworu;
- stężenie procentowe objętościowo-objętościowe ( % v/v ), czyli liczbę części objętościowych substancji rozpuszczonej w 100 tych samych częściach objętościowych roztworu, np. liczba ml substancji rozpuszczonej w 100 ml roztworu. Podstawową jednostką masy w układzie SI jest kilogram (kg), którego wzorzec przechowywany jest w Międzynarodowym Biurze Miar i Wag w Sèvres koło Paryża. Ze względu na wielkości naważek, z jakimi mamy do czynienia w chemii, czy biochemii, w naukach tych najczęściej operuje się, jako jednostką masy, gramem (g). Z tego też powodu w obliczeniach chemicznych widząc zapis % (w/w) rozumiemy liczbę gramów odważonej substancji rozpuszczonej w 100 g roztworu. Podstawową jednostką objętości w układzie SI jest m^3 , ale w praktyce najczęściej stosuje się dm^3 , czyli 1 litr (l) lub cm^3 , czyli 1 ml. Z tego też powodu zapis % (w/v), czy % (v/v) oznacza odpowiednio liczbę gramów substancji rozpuszczonej w 100 ml roztworu, a w drugim przypadku liczbę ml substancji zawartą w 100 ml roztworu. W naukach ścisłych stosuje się także odpowiednio pod- i nadwielokrotności podanych jednostek.
1. Sporządzanie roztworów o określonym
stężeniu procentowym
W celu sporządzenia roztworu o danym stężeniu procentowym należy odważyć odpowiednią liczbę gramów danej substancji, następnie rozpuścić ją w niewielkiej objętości rozpuszczalnika i uzupełnić do żądanej objętości lub masy całego roztworu. UWAGA! Jeśli w zadaniach o roztworach nie podany jest rodzaj rozpuszczalnika, należy traktować roztwory jako roztwory wodne.
2. Sporządzanie roztworów o określonym
stężeniu molowym
W celu przygotowania roztworu o określonym stężeniu molowym należy obliczoną liczbę moli substancji rozpuścić w mniejszej objętości rozpuszczalnika i następnie uzupełnić rozpuszczalnikiem do podanej objętości końcowej.
ROZDZIAŁ DRUGI:
ROZTWORY BUFOROWE
Roztwory buforowe, zwane też krócej buforami to mieszaniny:
- słabego kwasu i soli powstałej w reakcji tego słabego kwasu z mocą zasadą;
- słabej zasady i soli powstałej w reakcji tej słabej zasady z mocnym kwasem;
- dwóch wodorosoli tego samego kwasu różniących się znacznie zdolnością dysocjacji. Roztwory buforowe cechuje zdolność utrzymywania niezmiennej, lub zmiennej w niewielkim stopniu wartości pH w pewnym przedziale pH, charakterystycznym dla danego typu buforu. Przykładowo, bufor octanowy o stężeniu 0,1 mol/dm^3 wykazuje właściwości buforujące, czyli zachowuje stałą wartość pH w zakresie pH od 3,6 do 5,6. Można więc sporządzić bufor octanowy o stężeniu 1 mol/dm^3 , o wybranym pH z wcześniej wspomnianego zakresu np. bufor o pH 3,8 i mimo iż do tak sporządzonego buforu dodawać będziemy kwasu lub zasady to pH tego buforu przez długi czas pozostanie niezmienione. Ta zdolność przeciwstawiania się zmianom pH po wprowadzeniu kwasu lub zasady do roztworu buforowego nazywa się pojemnością buforową. Stosunek liczby moli jonów H 3 O+^ lub OH-^ wprowadzonych do roztworu buforowego o objętości jednego litra do spowodowanych przez te jony zmian pH tego roztworu jest miarą pojemności buforowej buforu, czyli innymi słowy pojemność buforowa to taka ilość kwasu, lub zasady, która jest potrzebna do zmiany pH roztworu o jednostkę. Roztwory buforowe w biochemii odgrywają bardzo istotną rolę zarówno w stosowanych metodach analitycznych, jak i w procesach zachodzących w organizmach żywych. W metodach analitycznych zapewniają np. optymalne warunki do wyznaczania aktywności badanych enzymów, pozwalają na poprawne przeprowadzenie wielu oznaczeń tak jakościowych, jak i ilościowych, są niezbędne w izolacji białek, kwasów nukleinowych, czy organelli komórkowych. Bufory znajdują też ogromne zastosowanie w hodowlach tkankowych. Odpowiednie pH pożywek w hodowlach in vitro umożliwia optymalne wchłanianie składników odżywczych a tym samym właściwy wzrost i rozwój hodowanych komórek, tkanek, narządów, czy organizmów. W organizmie człowieka za utrzymywanie równowagi kwasowo-zasadowej odpowiedzialne są bufory krwi, do których należą:
- bufor wodorowęglanowy HCO 3 - /H 2 CO 3 ;
- bufor fosforanowy HPO 42 - /H 2 PO 4 - ;
- białczanowi, czyli białka [białko-]/[białko–H];
- hemoglobinianowy HbO 2 - /HbO 2 – H;
- amonowy NH 4 OH/NH 4 Cl
1. Sporządzanie roztworów buforowych
Odczynniki: 0,2 mol/ dm^3 roztwór CH 3 COOH, 0,2 mol/dm^3 roztwór CH 3 COONa Wykonanie: Korzystając z tabeli 2.1 sporządzić 100 ml buforu octanowego poprzez pobranie i zmieszanie odpowiednich objętości roztworów wyjściowych elektrolitów w wąskiej, wysokiej zlewce o pojemności 150 ml. Do mieszania zastosować mieszadło magnetyczne. Tabela 2.1 Bufor octanowy wg Walpole’a (pH = 3,6-5,6) kwas octowy [ml] octan sodowy [ml] pH 18,5 1,5 3, 17,6 2,4 3, 16,4 3,6 4, 14,7 5,3 4, 12,6 7,4 4, 10,2 9,8 4, 8,0 12,0 4, 5,9 14,1 5, 4,2 15,8 5, 2,9 17,1 5, 1,9 18,1 5,
2. Dokonanie pomiaru pH otrzymanego buforu Wykonanie:
- Przygotować mieszadło magnetyczne, wąską zlewkę o pojemności 150 ml, pH-metr, pipetę Pasteura, tryskawkę z wodą destylowaną i bibułę.
- Przed przystąpieniem do dokonania pomiaru pH za pomocą pH-metru konieczne jest zawsze jego wykalibrowanie.
- Po poinstruowaniu przez prowadzącego wykalibrować pH-metr, zmierzyć pH otrzymanego w poprzednim ćwiczeniu buforu i porównać otrzymany wynik z wynikiem przewidywanym. 3. Przygotowanie buforu metodą ciągłej kontroli pH Odczynniki: 0,2 mol/ dm^3 roztwór CH 3 COOH, 0,2 mol/dm^3 roztwór CH 3 COONa Wykonanie:
- Przygotować mieszadło magnetyczne, wąską zlewkę o pojemności 150 ml, pH-metr, pipetę Pasteura, tryskawkę z wodą destylowaną i bibułę.
- W zlewce umieścić zastosowaną w pierwszym ćwiczeniu objętość wyjściowego roztworu CH 3 COOH.
- Za pomocą pH-metru zmierzyć pH umieszczonego w zlewce roztworu.
- W zlewce umieścić element mieszający a zlewkę ustawić na włączonym mieszadle magnetycznym.
- W zlewce zanurzyć elektrodę ( ostrożnie, aby nie uległa uszkodzeniu! ).
- Do oddzielnej zlewki odmierzyć 100 ml roztworu CH 3 COONa.
- Ciągle kontrolując pH dodawać pipetą Pasteura odmierzony roztwór CH 3 COONa aż do uzyskania pH zadanego przez prowadzącego w pierwszym ćwiczeniu.
- Zmierzyć zużytą objętość roztworu CH 3 COONa.
- Obliczyć stosunek objętości kwasu octowego do objętości CH 3 COONa zużytej w celu uzyskanie buforu o określonym pH. Wynik porównać z danymi z tabeli 2.1. 4. Pomiar pH wybranych płynów ustrojowych Wykonanie: Zgodnie ze wskazówkami prowadzącego dokonać pomiaru pH surowicy, moczu, roztworu śliny (przygotować zgodnie ze wskazówkami prowadzącego). Zaliczenie: Po uprzednim podpisaniu wyników przez prowadzącego porównać i przedyskutować otrzymane wyniki z danymi literaturowymi. 5. Pomiar pH wybranych składników odżywczych Wykonanie: Zgodnie ze wskazówkami prowadzącego dokonać pomiaru pH mleka, jogurtu, soku owocowego, naparu kawy i herbaty. Zaliczenie: Na podstawie uzyskanych wyników uporządkować badane roztwory według wzrastającego pH. Wyjaśnić obserwowane różnice pH.
metionina Met M fenyloalanina Phe F tryptofan Trp W prolina Pro P HYDROFILOWE OBOJ ĘTNE seryna Ser S treonina Thr T cysteina Cys C tyrozyna Tyr Y asparagina Asn N
glutamina Gln Q HYDROFILOWE KWA ŚNE kwas asparaginowy Asp D kwas glutaminowy Glu E HYDROF ILOWE ZASADOWE lizyna Lys K arginina Arg R histydyna His H
1. Wykrywanie i identyfikacja aminokwasów 1.1. Reakcje grup aminowych
1.1.1. Reakcja z ninhydryną
Podstawa teoretyczna: Aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają deaminacji i dekarboksylacji przekształcając się w odpowiedni aldehyd a w wyniku reakcji powstaje ponadto amoniak, dwutlenek węgla i zredukowana ninhydryna. Zredukowana ninhydryna reaguje następnie z amoniakiem i inną cząsteczką ninhydryny tworząc niebieskofiołkowy kompleks zwany purpurą Ruhemanna. Prolina daje kompleks o barwie żółtej, gdyż zamiast grupy aminowej zawiera grupę iminową. Odczynniki: 0,1 % roztwór glicyny, 0,1 % roztwór ninhydryny w 50 % etanolu, roztwór białka
1.2.2. Reakcja Sakaguchi’ego (wykrywanie reszt
guanidyny w argininie)
Podstawa teoretyczna: Jest to bardzo czuła reakcja, pozwalająca na wykrycie mikrogramowych ilości argininy w próbce. Jest też bardzo specyficzna. W środowisku zasadowym i w obecności bromianu sodu lub potasu działających jako silny utleniacz, związki zawierające resztę guanidyny reagują z α-naftolem dając barwne pochodne, niestety nietrwałe, gdyż dalej ulegające utlenianiu pod wpływem ciągle obecnego w próbce utleniacza. Pochodne te można stabilizować przez dodatek około 1 cm^3 40 % roztworu mocznika. Arginina jest nie tylko aminokwasem białkowym, ale też ważnym składnikiem cyklu mocznikowego: z niej powstaje mocznik. Odczynniki: roztwór białka, 20 % roztwór NaOH, 2 % alkoholowy roztwór α-naftolu, woda bromowa Wykonanie:
- Przygotować trzy probówki.
- W pierwszej umieścić 1 cm^3 roztworu białka, w drugiej, jako próbie ślepej 1 cm^3 wody destylowanej.
- Do wszystkich probówek dodać 1 cm^3 roztworu NaOH i 2-3 krople roztworu α-naftolu a następnie dobrze wymieszać i wprowadzić kroplę wody bromowej.
- Porównać wyniki.
1.2.3. Reakcja Pauly’ego (wykrywanie pierścienia
imidazolowego histydyny)
Podstawa teoretyczna: Histydyna dzięki obecności w swojej cząsteczce pierścienia imidazolowego, w obecności węglanu(IV) sodu zapewniającego odczyn zasadowy, ulega reakcji sprzęgania z kwasem p-diazobenzenosulfonowym, tworząc pomarańczowy barwnik. Odczynniki: 0,5 % roztwór histydyny, 0,5 % roztwór kwasu sulfanilowego w 2 M HCl, 0,5 % roztwór NaNO 2 , Na 2 CO 3 in subst. Wykonanie:
- Przygotować dwie probówki.
- W jednej probówce umieścić około 5 cm^3 0,5 % roztworu kwasu sulfanilowego i chłodząc probówkę zimną wodą dodać 0,5 cm^3 0,5 % roztworu NaNO 2.
- Zalkalizować powstały roztwór dodając Na 2 CO 3 in subst. (aż do uzyskania lekko żółtego zabarwienia) i wlać 1 cm^3 0,5 % roztworu histydyny. Zaobserwować wynik.
- W drugiej probówce wykonać próbę ślepą, zamiast histydyny dodając odpowiednią objętość wody
- Porównać wyniki. 2. Ilościowe oznaczanie glicyny metodą miareczkowania formolowego (reakcja Sörensena) Podstawa teoretyczna: Podczas miareczkowania roztworu glicyny (podobnie jak każdego innego aminokwasu) roztworem NaOH, z grypy – NH 3 +^ glicyny oddysocjowują jony H+, a jon obojnaczy aminokwasu przechodzi w karboanion. Uwolnione jony H+^ oddziaływają z jonami OH-, ale mogą również przyłączać się do powstałych wcześniej w czasie miareczkowania grup – NH 2 odtwarzając grupy – NH 3 +. Istnienie w roztworze cząsteczek glicyny wyłącznie z grupami – NH 2 , ma miejsce dopiero wówczas, gdy roztwór ten osiąga pH powyżej 12. Nie są znane takie
wskaźniki alkacymetryczne (wskazujące alkaliczne pH roztworu przez zmianę zabarwienia), które by zmieniały barwę przy tak wysokiej wartości pH. Fenoloftaleina jest wskaźnikiem alkacymetrycznym, który przechodzi z formy bezbarwnej (w środowisku kwaśnym lub obojętnym) do czerwonej (w środowisku zasadowym). Jej zakres pH zmiany barwy to 8,2-10,0. Tak wiec i fenoloftaleina nie pozwala wykryć momentu, gdy wszystkie cząsteczki glicyny posiadają już tylko grupy – NH 2 , czyli występują w postaci karboanionów. Problem ten można jednak ominąć blokując uwolnione od jonów H+^ reszty – NH 2 glicyny. W tym celu do roztworu glicyny dodaje się roztwór formaldehydu o pH odpowiadającym dolnej granicy rejestrowanego przez fenoloftaleinę, czyli około 8,3. Gdy dodamy roztwór formaldehydu o takim pH do roztworu glicyny zawierającym już dopiero co zabarwioną na różowo fenoloftaleinę, pod wpływem dodawanego roztworu NaOH, to wówczas nastąpi zablokowanie wszystkich w danej chwili wolnych od jonów H+^ reszt aminowych glicyny. Za zablokowanie tych właśnie reszt odpowiedzialny jest formaldehyd, który reaguje z grupami – NH 2 , a nie reaguje z grupami – NH 3. Ponieważ jony H+^ nie będą mogły ponownie wiązać się z grupami – NH 2 , które zostały zablokowane, dodatek formaldehydu spowoduje obniżenie pH roztworu glicyny. W obecności formaldehydu uwolnione z grupy – NH 3 +^ jony H+^ nie będą już mogły łączyć się z resztami – NH 2 , a jedynie z nie zablokowanymi grupami – COO-^ tego aminokwasu co umożliwi oznaczenie ilościowe glicyny metodą miareczkowania roztworem NaOH w obecności fenoloftaleiny. W takich warunkach końcowy punkt miareczkowania z pH 12 przesuwa się do pH 9, co odpowiada utrzymującej się kilka minut różowej barwie roztworu zawierającego fenoloftaleinę. Odczynniki: wodne roztwory glicyny o nieznanych stężeniach, handlowy roztwór formaldehydu, 0,1 mol/dm^3 roztwór NaOH, fenoloftaleina Wykonanie:
- Przygotować biuretę, dwie kolby płaskodenne o objętości 100 ml każda, lejek i cylinder miarowy o pojemności 10 ml.
- Biuretę napełnić roztworem NaOH.
- W pierwszej kolbie umieścić 10 ml formaldehydu, dodać kilka kropel fenoloftaleiny, po wymieszaniu miareczkować roztworem NaOH do uzyskania lekko różowego zabarwienia tj. pH około 8,5.
- W drugiej kolbie przygotować 10 ml zadanego roztworu glicyny, dodać kilka kropel fenoloftaleiny i wprowadzać kroplami NaOH, aż do uzyskania lekko różowego zabarwienia tj. pH ok. 8,5.
- Zanotować zużytą objętość 0,1 M roztworu NaOH.
- Zawartość pierwszej kolby przelać do drugiej, wymieszać, wyjaśnić zaobserwowany wynik.
- Wymieszaną zawartość obu kolb miareczkować 0,1 M roztworem NaOH aż do uzyskania lekko różowego zabarwienia utrzymującego się przez kilka minut. Opracowanie wyników: z ilości ml zużytego na miareczkowanie 0,1 M roztworu NaOH obliczyć zawartość glicyny (w mg) oraz znając objętość miareczkowanego roztworu podać jego stężenie (mol/l).
Odczynniki: roztwór białka, 10 % roztwór NaOH, 1 % roztwór CuSO 4 Wykonanie:
- Przygotować dwie probówki.
- W jednej z nich umieścić około 2 ml roztworu białka, dodać taką samą objętość 10 % roztworu NaOH i parę kropel 1 % roztworu CuSO 4. Zaobserwować wynik.
- W drugiej probówce wykonać tę samą reakcję, ale dla próby ślepej (zamiast roztworu białka dodać taką samą objętość wody destylowanej). Zaobserwować wynik.
- Porównać i wyjaśnić otrzymane wyniki. 4. Denaturacja białek Podstawa teoretyczna: Charakterystyczna dla danego białka natywna struktura przestrzenna może ulec uszkodzeniu pod wpływem zadziałania określonych czynników fizycznych i chemicznych: wysokiej temperatury, promieniowania UV, obecności soli metali ciężkich, detergentów, mocnych zasad i kwasów nieorganicznych a także kwasów i rozpuszczalników organicznych. Czynniki te powodują rozerwanie wiązań niekowalencyjnych, stabilizujących strukturę białkową. Proces zniszczenia struktury IV, III oraz II-rzędowej, przy jednoczesnym zachowaniu oryginalnej sekwencji aminokwasów (struktury I-rzędowej), nazywany jest denaturacją i wiąże się z częściową lub całkowitą utratą właściwości biologicznych oraz zmianą charakterystyki fizykochemicznej białka. Mechanizm dentauracji białka jest zróżnicowany, gdyż odmienne czynniki denaturujące mogą wpływać na zerwanie różnych typów wiązań. Zdenaturowane białko często koaguluje, zwłaszcza w warunkach pH zbliżonych do pI. W pH wyższym od pI, białka wykazują wypadkowy ładunek ujemny i stają się podatne na reakcje z kationami metali ciężkich (Pb2+, Fe2+, Cu2+, Hg+), tworząc z nimi nierozpuszczalne i trwałe kompleksy. Z kolei w pH niższym od pI białka przyjmują formę kationową i tworzą z niektórymi kwasami organicznymi (np. kwasem sulfosalicylowym, pikrynowym, trichlorooctowym) nierozpuszczalne związki. Niekiedy zdarza się, że denaturacja jest procesem odwracalnym i po usunięciu czynnika denaturującego oraz zapewnieniu odpowiednich warunków, białko odzyskuje natywną konformację przestrzenną (renaturacja). Odczynniki: roztwór białka, 1 % roztwory: HgCl 2 , Pb(NO 3 ) 2 oraz AgNO 3 , 95 % roztwór etanolu Wykonanie:
- Wpływ metali ciężkich : Przygotować trzy probówki, w każdej umieścić około 2 cm^3 roztworu białka. Do poszczególnych probówek dodawać kroplami: do pierwszej roztwór HgCl 2 , do drugiej roztwór Pb(NO 3 ) 2 a do trzeciej AgNO 3. Zaobserwować i zinterpretować wyniki.
- Wpływ etanolu : krótkotrwałe działanie etanolu powoduje wytrącanie białka z roztworu, ale nie powoduje denaturacji. Zachodzi ona dopiero po dłuższym czasie działania etanolu i w wyższej temperaturze (20- 30 ºC). W dwóch probówkach umieścić po około 1 cm^3 roztworu białka i trzy razy tyle roztworu etanolu: zaobserwować wynik. Do pierwszej probówki dodać wody, wymieszać, zaobserwować wynik. Drugą probówkę zostawić na około godzinę a po tym czasie dodać wody i zaobserwować wynik. Wszystkie wyniki porównać i zinterpretować.
- Wpływ temperatury : w probówce umieścić około 2 cm^3 roztworu białka i ogrzewać do wrzenia. Zaobserwować i zinterpretować wynik.
ROZDZIAŁ PIĄTY:
ENZYMY
Enzymy to biokatalizatory. Przedrostek bio pochodzi od greckiego słowa bios oznaczającego życie a katalizator to substancja chemiczna przyspieszająca przebieg reakcji chemicznej. Można więc powiedzieć, że enzymy to z jednej strony katalizatory reakcji podtrzymujących życie, a z drugiej że są to katalizatory wytwarzane przez organizmy żywe. Pod względem chemicznym enzymy należą do białek, choć znane są biokatalizatory będące RNA i określane jako rybozymy , a nawet DNA zwane DNAzymami. Nazwa enzymy pozostała zarezerwowana tylko dla biokatalizatorów będących białkami. Zasadniczą częścią cząsteczki enzymu jest centrum aktywne, do którego wiąże się substrat. Niektóre enzymy to białka proste zbudowane tylko z aminokwasów (chymotrypsyna, trypsyna), inne składają się z części białkowej i niebiałkowej. Jeżeli część niebiałkowa związana jest trwale z enzymem, nosi nazwę grupy prostetycznej. Jeżeli część niebiałkowa wiąże się z enzymem odwracalnie, nazywa się ją albo kofaktorem, gdy jest to mała, nieorganiczna cząsteczka, albo koenzymem gdy jest to większa cząsteczka organiczna. Część białkowa enzymu bez kofaktora lub koenzymu nazywana jest apoenzymem. Apoenzym, do którego została przyłączona grupa niebiałkowa to holoenzym. holoenzym ⇔ apoenzym + koenzym (kofaktor) Część białkowa enzymu decyduje o specyficzności substratowej a w wielu przypadkach ma wpływ na kierunek reakcji enzymatycznej. Koenzym pomaga w działaniu enzymu np. poprzez przenoszenie atomów lub grup chemicznych z donora na akceptor. Międzynarodowa Unia Biochemiczna opracowała zasady klasyfikacji i nazewnictwa enzymów oparte na rodzaju katalizowanej reakcji i wyodrębniła w ten sposób 6 klas głównych enzymów. Są to:
- oksydoreduktazy – katalizują procesy utlenienia i redukcji;
- transferazy – przenoszą grupy atomów z jednej cząsteczki na drugą;
- hydrolazy – katalizują reakcje hydrolizy różnych ugrupowań;
- liazy – katalizują reakcje niehydrolitycznego rozszczepienia substratu;
- izomerazy – katalizują odwracalne reakcje przekształceń strukturalnych cząsteczki substratu;
- ligazy – odpowiedzialne za reakcje łączenia dwóch cząsteczek nowym wiązaniem z wykorzystaniem cząsteczek ATP. W obrębie tych klas głównych wyróżnia się wiele podklas i pod-podklas, co sprawia, że każdemu ze znanych enzymów można przypisać 4 cyfry. Pierwsza z nich oznacza numer klasy głównej, druga to numer podklasy, a trzecia to numer pod-podklasy. Czwarta cyfra oznacza numer enzymu w danej pod-podklasie danej podklasy i danej klasy głównej.
2. Inhibitory
Inhibitorami enzymów określamy związki, które hamują szybkość reakcji enzymatycznej. Inhibitory mogą działać na cząsteczkę enzymu swoiście lub nieswoiście. Inhibitory nieswoiste (niespecyficzne) są to substancje lub czynniki fizyczne (temperatura, rozpuszczalniki organiczne, itp.), które działając na cząsteczkę zmieniają jego natywną strukturę i prowadzą do inaktywacji enzymu. Inhibitory swoiste (specyficzne) oddziaływujące z miejscem aktywnym enzymu to związki reagujące z grupami bocznymi aminokwasów znajdujących się w miejscu aktywnym enzymu i powodującymi jego inaktywację. Przykładem tego rodzaju inhibitorów mogą być związki reagujące z grupami sulfhydrylowymi tworząc disiarczki lub merkaptydy. Następną grupą inhibitorów swoistych są związki reagujące z kofaktorami. Do tej grupy zaliczyć można cyjanki
Występuje np. w ślinie. Powoduje ona rozrywanie wiązań łączących cząsteczki glukozy. Dzięki obecności jodu można tą reakcję obserwować, gdyż im krótszy łańcuch reszt glukozy, tym barwa mniej intensywna. Od fioletowej przechodzi poprzez niebieskofiołkową do czerwonej, a kiedy w roztworze są już tylko dwucukry i monocukry, roztwór staje się bezbarwny. Odczynniki: świeżo sporządzony 1 % roztwór skrobi, 0,002 % roztwór jodu w jodku potasu Przygotowanie roztworu amylazy śliny: przepłukać usta ciepłą wodą, następnie pobrać łyk wody do ust i po kilku minutach wypluć do zlewki, czynność tę powtórzyć kilkakrotnie aż uzyska się powyżej 10 ml roztworu amylazy. Wykonanie:
- Do probówki odmierzyć 7 ml świeżo przyrządzonego roztworu skrobi i 7 ml otrzymanego roztworu amylazy śliny.
- Dokładnie wymieszać a następnie probówkę umieścić w łaźni wodnej w temperaturze 40 °C na około 5 minut.
- W tym czasie przygotować pipetę o pojemności 1 ml i 10 probówek. W każdej probówce umieścić po 2 ml roztworu jodu w jodku potasu.
- Po upływie 5 minut z probówki zawierającej skrobię i enzym pobierać co pół minuty 1 ml roztworu i umieszczać w kolejnych wcześniej przygotowanych probówkach. Obserwować zabarwienie.
ROZDZIAŁ SZÓSTY:
CUKROWCE
Cukrowce, zwane też sacharydami lub węglowodanami to związki organiczne złożone z węgla, wodoru i tlenu, których podstawową jednostką budulcową są monosacharydy, zwane inaczej cukrami prostymi. Cukry proste natomiast to wielowodorotlenowe aldehydy lub ketony. Zawierają od trzech do ośmiu atomów węgla w cząsteczce. Najczęściej jednak spotykane są pentozy i heksozy, czyli cukry proste zbudowane z pięciu i sześciu atomów węgla. Jeśli zawierają grupę aldehydową to zaliczamy je do aldoz , jeśli grupę ketonową to do ketoz. Do najpopularniejszych w przyrodzie pentoz należy aldopentoza wchodząca w skład np. DNA, zwana deoksyrybozą, czy obecna w RNA ryboza. Heksozy są najpowszechniej reprezentowane przez aldoheksozę, jaką jest glukoza i ketoheksozę, jaką jest fruktoza. Monosacharydy, oprócz najprostszej ketotriozy (dihydroksyacetonu), zawierają jeden lub kilka atomów węgla asymetrycznego. Obecność ośrodków asymetrycznych powoduje występowanie zjawiska skręcalności płaszczyzny światła spolaryzowanego, którego miarą jest skręcalność właściwa. W zależności od liczby asymetrycznych atomów węgla w cząsteczce, danemu wzorowi sumarycznemu odpowiada liczba stereoizomerów określana wzorem 2 n, gdzie n jest liczbą atomów węgla asymetrycznego. Wśród stereoizmerów wyróżnia się dwa szeregi: D i L. Litery D ( dextro ) i L ( laevo ) opisują konfigurację przy węglu asymetrycznym położonym najdalej od węgla grupy karbonylowej. Występujące w organizmie człowieka cukrowce to głównie przedstawiciele szeregu konfiguracyjnego D. Monosacharydy mające 5 lub więcej atomów węgla w cząsteczce mogą występować w formach pierścieniowych (półacetalowych). W wyniku powstania takiego pierścienia powstaje też nowa grupa hydroksylowa zwana hydroksylem półacetalowym. Pentozy i ketoheksozy ulegają cyklizacji tworząc pierścień zwany furanozowym a aldoheksozy pierścień zwany piranozowym. Utworzenie formy pierścieniowej powoduje pojawienie się w cząsteczce dodatkowego ośrodka asymetrii zwanego węglem anomerycznym. U aldoz jest to pierwszy a u ketoz drugi atom węgla. Izomery różniące się ułożeniem podstawników przy tym anomerycznym atomie węgla nazywamy anomerami. Istnieją dwa anomery: alfa i beta. Jeżeli łańcuchowa forma D zamknie się w pierścień a jej hydroksyl półacetalowy będzie zwrócony na dół, to jest to anomer alfa , jeśli do góry to beta. Przy formie L odwrotnie. Monosacharydy mogą łączyć się ze sobą wiązaniem O-glikozydowym (utworzonym w wyniku oddziaływania dwóch hydroksyli, przy czym mogą to być zarówno hydroksyle alkoholowe, jak i półacetalowe). W wyniku takiego połączenia powstają cukrowce złożone, wśród których wyróżniamy zarówno dwucukry (np. sacharozę), oligosacharydy (zbudowane z od trzech do dziesięciu reszt cukrów prostych), jak i polisacharydy (jak np. skrobia, czy obecny w mięśniach i wątrobie zwierząt i człowieka glikogen). Cząsteczki polisacharydów mogą być nierozgałęzione (np. celuloza, amyloza) lub rozgałęzione (np. amylopektyna, glikogen). Jedną z podstawowych funkcji węglowodanów jest uruchamianie i magazynowanie energii (glukoza, skrobia, glikogen). Węglowodany pełnią ponadto inne, bardzo zróżnicowane funkcje: strukturalną (celuloza, chityna), odgrywają rolę w procesach rozpoznania międzykomórkowego, adhezji komórek, biorą udział w regulacji transportu przez błony komórkowe i cytoplazmatyczne, czy w utrzymaniu właściwych stosunków wodnych w komórce.
1. Wykazanie charakteru alkoholowego
monosacharydów
Podstawa teoretyczna: Słodki smak monosacharydów pochodzi od zawartych w ich cząsteczkach grup hydroksylowych. Grupy te nadają również monosacharydom charakter alkoholowy, który można potwierdzić i wykryć przez obserwację właściwości kompleksujących cukrów prostych. Powstający osad wodorotlenku miedzi(II) w obecności cukrowca ulega rozpuszczeniu ze względu na powstały związek kompleksujący miedź. Odczynniki: 1 % roztwór glukozy, 1 % roztwór siarczanu(VI) miedzi(II), 0,2 mol/dm^3 roztwór NaOH
Jednakże w środowisku zasadowym albo silnie kwaśnym, formy pierścieniowe cukrów przechodzą w formy łańcuchowe. Aktywna, wolna grupa aldehydowa (lub ketonowa) redukuje niektóre jony metali. W trakcie redukcji, cukry ulegają utlenieniu do odpowiednich kwasów cukrowych (np. aldozy do kwasów aldonowych). Właściwości redukujące wykazują wszystkie monosacharydy i niektóre disacharydy, takie jak maltoza i laktoza. Takich właściwości nie wykazują natomiast polisacharydy i disacharydy (np. sacharoza), których wiązanie glikozydowe tworzone jest z udziałem dwóch węgli acetylowych, czyli takie cukry, w których żaden z pierścieni nie może przejść do formy łańcuchowej i uwolnić wykazującej właściwości redukujące grupy aldehydowej, bądź ketonowej. Właściwości redukujące cukrów stanowią podstawę wielu oznaczeń analitycznych. 3.1. Próba lustra srebrnego (Tollensa) Podstawa teoretyczna : W środowisku zasadowym, wolne ugrupowania karbonylowe redukują jony Ag1+^ do Ag^0. Dodawany AgNO 3 w środowisku reakcji tworzy nierozpuszczalny w wodzie wodorotlenek srebra, a więc jony srebrowe nie są dostępne w roztworze. Aby mogły być dostępne i zredukowane przez cukier, dodaje się nadmiaru amoniaku, który przeprowadza nierozpuszczalny w wodzie wodorotlenek srebra w rozpuszczalny w wodzie wodorotlenek diamina srebra. W ten sposób jony srebrowe mogą być dostępne dla cukru i w podwyższonej temperaturze ulegać redukcji. Odczynniki: 1 % roztwory cukrów, 0,1 mol/dm^3 roztwór AgNO 3 , NH 3 aq Wykonanie:
- Przygotować trzy probówki.
- W każdej probówce umieścić około 5 ml roztworu AgNO 3 i dodawać kroplami amoniak, aż powstający osad AgNO 3 ulegnie rozpuszczeniu.
- Następnie: w pierwszej umieścić około 1 ml wody destylowanej (próba ślepa), do drugiej dodać około 1 ml dowolnego monosacharydu a do trzeciej 1 ml sacharozy.
- Zawartość każdej probówki wymieszać, probówki umieścić w zlewce z ciepłą woda i ogrzewać na niewielkim płomieniu. 3.2. Reakcja Trommera Podstawa teoretyczna: Wiele reakcji redukcyjnych cukrowców opiera się na redukcji kationów miedzi Cu2+^ do Cu1+. Tworzący się w środowisku zasadowym niebieski osad Cu(OH) 2 wchodzi w reakcję z grupami OH cukrowca, dając rozpuszczalny w wodzie kompleks barwy ciemnoniebieskiej, uwalniając w ten sposób do roztworu jony miedzi Cu2+. Jony miedzi Cu2+ ulegają najpierw redukcji do Cu1+^ występującego w rozpuszczalnym wodorotlenku CuOH, który podczas ogrzewania traci wodę i przechodzi w barwny, nierozpuszczalny w wodzie tlenek miedzi(I). Odczynniki: 1 % roztwory cukrów, 1 % roztwór CuSO 4 , 0,2 mol/dm^3 roztwór NaOH Wykonanie:
- Przygotować trzy probówki.
- W pierwszej umieścić około 2 ml wody destylowanej (próba ślepa), do drugiej dodać około 2 ml dowolnego monosacharydu a do trzeciej 2 ml sacharozy.
- Do każdej probówki dodać około 2 ml NaOH a następnie kroplami roztwór CuSO 4 , dopóki wydzielający się osad przechodzi do roztworu.
- Zawartość każdej probówki wymieszać a następnie ogrzać. 4. Polisacharydy 4 .1. Wykrywanie skrobi
Podstawa teoretyczna: Skrobia na skutek reakcji z cząsteczkami jodu barwi się na kolor niebieski. Barwa kompleksu zależy od struktury przestrzennej łańcucha polisacharydu, gdyż cząsteczki jodu wnikają do wnętrza tworzonej przez skrobię spirali. Na jeden skręt takiej spirali tworzonej przez 6 cząsteczek glukozy przypada jedna cząsteczka jodu. Kompleks jodu z amylozą ma inną barwę niż z amylopektyną. Oba te związki są homoglikanami, czyli polisacharydami zbudowanymi z jednego rodzaju reszt monosacharydów, w tym wypadku z glukozy, ale różnią się stopniem rozgałęzienia łańcucha. Amyloza nie jest rozgałęziona, a amylopektyna posiada rozgałęzienia. Zabarwienia kompleksu nie obserwuje się w wysokich temperaturach, gdyż w takich warunkach spiralnie skręcony łańcuch skrobi ulega rozprostowaniu. Odczynniki: 1 % roztwór kleiku skrobiowego, odczynnik Lugola (jod w roztworze jodku potasu) Wykonanie:
- Do około 1 ml roztworu skrobi dodać kilka kropel płynu Lugola.
- Zaobserwować i wyjaśnić wynik.
- Zawartość probówki podgrzać.
- Zaobserwować i wyjaśnić wynik.
- Zawartość probówki ochłodzić.
- Zaobserwować i wyjaśnić wynik.