Baixe Alelopatia uma área emergente e outras Notas de estudo em PDF para Engenharia de Produção, somente na Docsity!
ALELOPATIA: UMA ÁREA EMERGENTE DA ECOFISIOLOGIA^1
ALFREDO GUI FERREIRA^2 E MARIA ESTEFÂNIA ALVES AQUILA^3
(^2) Departamento de Botânica, Universidade de Brasília e 3 Laboratório de Fisiologia Vegetal, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
RESUMO - Alelopatia foi definida e a ação de aleloquímicos examinada em sistemas agroculturais, florestais e de vegetação nativa, terrestre ou aquática. Parâmetros fisiológicos de avaliação da alelopatia na germinação de sementes e no crescimento de plântulas foram discutidos. Compostos secundários e suas ações, bem como suas interações com o solo e microorganismos, foram analisados. A relação entre C:N, e também do P foram aludidos na complexidade da manifestação dos fenômenos alelopáticos. Distinção entre alelopatia, competição e interação foi discutida em conjunto com a formação de fitoalexinas que podem agir como aleloquímicos. A metodologia e os bioensaios mais usuais foram apresentados, bem como algumas das críticas comuns aos seus usos. Finalmente, o fenômeno alelopático foi relacionado com outros fenômenos que alteram ou influem sobre o crescimento de plantas.
TERMOS ADICIONAIS PARA INDEXAÇÃO: Agrossistema, alelopatia, aleloquímicos, horticultura,
interação.
ALELLOPATHY: AN EMERGING TOPIC IN ECOPHYSIOLOGY
ABSTRACT - Allelopathy was defined and the action of allelochemicals examined in agriculture and forest systems as well as natural terrestrial or aquatic vegetation. Physiological parameters for evaluation of allelopathy on seed germination and seedling growth were discussed. The action of secondary compounds and their interactions with the soil-microorganism system were analyzed. The relationship between C:N, as well as phosphorus level, were discussed in the complexity of the allelopathic phenomenon. Distinction among allelopathy, competition and interaction were discussed as well as the phytoalexins which can act as allelochemicals. The methodology and the bioassays normally utilized were presented and criticized. Finally, allelopathy was related to other physiological phenomena which affect the growth of plants.
ADDITIONAL INDEX TERMS: Agrosystems, allelochemical, allelopathy, horticulture, interaction.
- Palestra proferida no VII Congresso Brasileiro de Fisiologia Vegetal, Julho, 1999, Brasília, DF
- Professor Titular - visitante na Universidade de Brasília, CPG – Botânica, Laboratório de Termobiologia L.Labouriau; Bolsista do CNPq; Endereço permanente: Departamento de Botânica – UFRGS, Av. Bento Gonçalves 9500 prédio 43423, Campus do Vale, Porto Alegre, RS, CEP. 91009-
- Professora Adjunta - Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Laboratório de Fisiologia Vegetal; Bolsista da CAPES.
176 Ferreira e Aquila
INTRODUÇÃO
O termo alelopatia foi cunhado por Molisch (1937) e significa do grego allelon = de um para outro, pathós = sofrer. O conceito descreve a influência de um indivíduo sobre o outro, seja prejudicando ou favorecendo o segundo, e sugere que o efeito é realizado por biomoléculas (denominadas aleloquímicos) produzidas por uma planta e lançadas no ambiente, seja na fase aquosa do solo ou substrato, seja por substâncias gasosas volatilizadas no ar que cerca as plantas terrestres (Rizvi et al. , 1992). Rice (1984) definiu alelopatia como: “qualquer efeito direto ou indireto danoso ou benéfico que uma planta (incluindo microrganismos) exerce sobre outra pela produção de compostos químicos liberados no ambiente”. A atividade dos aleloquímicos tem sido usada como alternativa ao uso de herbicidas, inseticidas e nematicidas (defensivos agrícolas). A maioria destas substâncias provém do metabolismo secundário, porque na evolução das plantas representaram alguma vantagem contra a ação de microrganismos, vírus, insetos, e outros patógenos ou predadores, seja inibindo a ação destes ou estimulando o crescimento ou desenvolvimento das plantas (Waller, 1999). Assim, a vegetação de uma determinada área pode ter um modelo de sucessão condicionado às plantas pré-existentes e às substâncias químicas que elas liberaram no meio. Da mesma forma, no manejo agrícola, florestal e na horticultura, a ocupação prévia da área pode ter significativa influência sobre os cultivos que estão sendo instalados.
ALELOPATIA NA AGRICULTURA, SILVICULTURA E HORTICULTURA
A prática de rotação de cultivos, em agricultura, é bastante difundida no Brasil. Assim
numa época do ano é plantada uma cultura, na seguinte outra(s), de maneira que haja um rodízio de culturas. Isto visa não esgotar de forma precoce uma área cultivando uma mesma espécie, porque os requerimentos nutritivos explorados do solo seriam os mesmos, cultivo a cultivo. A repetição dos mesmos cultivos também facilita a instalação e continuidade de fitopatógenos no solo. Por outro lado, este procedimento, muito recomendado, pode ter uma limitação proveniente da incorporação de restos da cultura anterior no solo, onde podem desempenhar uma função alelopática devido aos compostos químicos liberados. Dependendo da cultura na rotação, os efeitos podem ser bastante danosos, com diminuição acentuada do crescimento e produtividade. Todas as plantas produzem metabólitos secundários, que variam em qualidade e quantidade de espécie para espécie, até mesmo na quantidade do metabólito de um local de ocorrência ou ciclo de cultivo para outro, pois muitos deles tem sua síntese desencadeada por eventuais vicissitudes a que as plantas estão expostas. A resistência ou tolerância aos metabólitos secundários que funcionam como aleloquímicos é mais ou menos específica, existindo espécies mais sensíveis que outras, como por exemplo Lactuca sativa (alface) e Lycopersicum esculentum (tomate), por isso mesmo muito usadas em biotestes de laboratório.
Cultura sazonal sobre outra
Há inúmeros registros da influência alelopática na rotação de culturas; dar-se-á destaque aqui para exemplos brasileiros, ainda que, muitas vezes, as plantas em instalação sejam exóticas a nossa flora. A resteva (restos da cultura anterior) de trigo retardou o crescimento de plantas de algodão (Hicks et al. , 1989) ou de arroz na rotação (Tabela 1), embora não tenha reduzido a germinação
178 Ferreira e Aquila
TABELA 3 - Efeito do sorgoleone sobre o crescimento de plantas de "ervas daninhas" em culturas hidropônicas. Adaptado de Nimbal et al. (1996).
Sorgoleone (mM) Digitaria sanguinalis Echinochloa crus-galli Abutilon theophratus Ipomea hederacea Massa seca da parte aérea 0 0,11 0,33 0,13 0, 10 0,06 0,31 0,15 0, 100 0,04 0,27 0,08 0, Massa seca das raízes 0 0,20 0,17 0,06 0, 10 0,20 0,13 0,05 0, 100 0,20 0,08 0,04 0,
Plantas invasoras sobre culturas sazonais
A substituição da vegetação espontânea por uma cultura é bastante comum no Brasil, pois há o costume de pousio sobre áreas agriculturais em várias regiões do país. Nestas áreas já cultivadas e deixadas em pousio, instala-se uma flora espontânea, onde aparecem várias plantas que podem contribuir para que o fenômeno de alelopatia se manifeste. Há na literatura um grande número de exemplos de influência alelopática sobre plantas de culturas ou forrageiras, porém as invasoras de cada local e aquelas de paises estrangeiros de outras latitudes não serão comentadas. Foi encontrado que Eragrostis plana (capim-anoni), uma invasora de pastagens de azevém ( Lolium multiflorum Lam), cornichão ( Lotus corniculatus L.) e trevo-branco ( Trifolium repens L.), tinha influência sobre a germinação e desenvol- vimento destas forragens (Coelho, 1986), mostrando que sua agressividade como invasora, pelo menos em parte, era devido a substâncias alelopáticas. Para verificar efeitos alelopáticos, os testes de germinação, em geral, são menos sensíveis do que aqueles que avaliam o
desenvolvimento das plântulas, como por exemplo massa ou comprimento da radícula ou parte aérea. Ainda assim, foi demonstrado que extratos da planta de cerrado Calea cuneifolia DC. (Coutinho e Hashimoto, 1971) e o extrato de Wedelia paludosa DC (mal-me-quer) (Barbosa, 1972) inibiam a germinação de tomate, enquanto extratos de ervilhaca ( Vicia sativa ) inibiam a germinação e o crescimento das raízes de alface (Medeiros e Lucchesi, 1993). Castro et al. (1983) encontraram que extratos aquosos da parte subterrânea de Cynodon dactylon (L.) Pers_._ (grama-seda), Cyperus rotundus L. (tiririca) e Sorghum halepense (L.) Pers. (capim massambará) inibiram a germinação e o crescimento do tomateiro. Em arroz o efeito foi apenas sobre o desenvolvimento da plântula (Castro et al. , 1984). Os ensaios (Figura 1) com os extratos foram realizados em placa de petri forradas com algodão e papel, onde o potencial mátrico do substrato é desprezível. Em condições de solo, onde a força de adsorção das micelas do solo pode exercer papel importante, inclusive de seqüestro dos possíveis aleloquímicos, os efeitos podem ser bem diversos (Inderjit e Dakshini, 1999).
Alelopatia: Uma Área ... 179
FIGURA 1 - Comprimento da radícula e da parte aérea (pa) de plântulas de arroz, sete dias após a aplicação de extratos de três invasoras, Cynodon dactylon, Cyperus rotundus e Sorghum halepense. Cont = controle sem aplicação; trat = tratado com extratos de invasoras. Extraído de Castro et al. (1984).
Restos de plantas sobre culturas ou invasoras
Destacou-se o uso da área de cultura em sucessão. Porém, muitas vezes, o que há no local é a vegetação nativa, que é ceifada ou carpida, por vezes amontoada para compostagem. Este fato é especialmente significativo em viveiros ou áreas de horticultura, onde há preparo do substrato para vasos e canteiros, por aproveitamento de restos orgânicos, às vezes obtidos de acúmulo de folhas e outras partes da vegetação nativa. Foi encontrado na Espanha que restos de Quercus robur L., Pinus radiata D. Don, Eucalyptus globulus Labill e Acacia melanoxylon R.Br. geravam inibição de crescimento e desenvolvimento de alface e o efeito alelopático era devido principalmente a compostos fenólicos (Souto et al. , 1994). Resultados semelhantes foram encontrados na África do Sul, quando foram
usados restos de Pinus patula , Eucalyptus grandis e Acacia mearnsii , neste caso contra a instalação de uma série de invasoras como Conyza sumatrensis, Trifolium spp. e Echinochloa utilis (Schumann et al. , 1995). No México restos de plantas de cultivos florestais ( Alnus firmifolia e Betula erecta ) e de plantas que vegetavam em valões de drenagem como Juncus sp., foram incorporados ao solo para aumentar a quantidade de matéria orgânica. Isto resultou em inibição aleloquímica ao milho e ao feijão, além do efeito contra as invasoras Chenopodium murale, Tradescantia crassifolia, Melilotus indicus e Amaranthus hybridus (Anaya et al. , 1987). Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit é uma espécie utilizada em várias partes do mundo (Rizvi e Rizvi, 1992). Chou e Kuo (1986) observaram que nos florestamentos com esta espécie, poucas plantas invasoras cresciam. Extratos da planta foram fitotóxicos tanto para
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Cynodon dactylon Cyperus rotundus Sorghum halepense
Comprimento (mm)
raiz-cont raiz-trat.
pa-cont. pa-trat
Alelopatia: Uma Área ... 181
TABELA 4 - Comprimento de radícula (mm) de várias culturas após 5 dias expostas a diferentes concentrações de extratos de Mimosa bimucronata. Adaptado de Ferreira et al. (1992).
Concentração (p/v) Espécie 1/2 1/4 1/8 Controle Alface 8,2 11,4 16,4 28, Arroz 14,0 18,4 28,1 42, Cenoura 11,0 17,3 22,2 38, Chicória 9,2 12,1 17,4 26, Couve 8,5 12,9 21,7 44, Pepino 11,0 20,7 31,5 67, Repolho 6,5 10,8 21,0 42, Tomate 12,0 25,1 33,1 82,
TABELA 5 - Efeito da matéria morta sobre a infestação por invasoras. Adaptado de Rodrigues et al. (1999).
Cobertura anterior Invasoras Solo em pousio Trigo Centeio Aveia preta Cobertura (% do solo) 67 14 3 1 No. de plantas 83 13 6 5
Há na literatura um número enorme de exemplos, dos quais se tomará apenas alguns. O cafeeiro é uma típica planta com um grande arsenal químico, no qual a xantina cafeína é a principal substância. Muitas xantinas são poderosas inibidoras do crescimento e podem acumular-se no solo junto aos cafeeiros, sendo inclusive fitotóxicas a radículas de plantas jovens da própria espécie (Waller et al. , 1986). Estes mesmos autores demonstraram que a cafeína é importante fonte de nitrogênio, mobilizada pela semente do cafeeiro na germinação. Esta substância, como outras xantinas
associadas, são poderosos aleloquímicos naturais, que controlam o desenvolvimento de invasoras dos cafezais (Anaya et al. , 1982). Compostos fenólicos o seus derivados, como o estilbeno e taninos presentes na casca de Picea engelmannii Parry, podem inibir o desenvolvimento de várias outras coníferas (Taylor e Shaw, 1983). Em plantios mistos de Juglans nigra e Alnus glutinosa foi encontrado que, após 8 anos, todas as plantas da segunda espécie morreram, começando pelos ramos pequenos, depois pelos galhos, tendo sido determinado a
182 Ferreira e Aquila
causa morte como proveniente de aleloquímicos produzidos pela primeira espécie e que se acumulavam na serrapilheira (Rietveld et al. , 1983). Efeito semelhante foi encontrado quando da presença de Kalmia angustifolia L., um arbusto nativo na América do Norte, impedindo o estabelecimento de mudas de Picea maritima num programa de reflorestamento (Mallik, 1987; 1992). O gênero Eucalyptus , introduzido da Austrália mas muito cultivado no Brasil, tem várias espécies consideradas alelopáticas, pelo menos em potencial. Na Tabela 6 apresenta-se fonte do
aleloquímico de várias espécies comumente cultivadas entre nós (Alves et al. , 1999). Entre as plantas lenhosas há aspectos bastante importantes e que as distinguem das demais quanto à alelopatia:
- Interação continuada, por vários anos, com a microflora do solo e suas interações alelopáticas;
- Queda sazonal de folhas, se a espécie for caducifólia, ou continuada, mas em pequena escala, se a espécie for perenifólia, acrescentando matéria morta à serrapilheira;
TABELA 6 - Aleloquímicos liberados por Eucalyptus spp. Adaptado de Alves et al. (1999) e Willis (1999).
Espécie Aleloquímico Fonte de liberação
E. baxteri ácidos gentisico, gálico, sináptico, caféico lixiviado de folhas; serrapilheira; solo
e elágico; glicosídeos; fenóis; terpenoides
E. camaldulensis 1.8 cineol; pireno; terpenos e fenóis;
ácidos gálico, ferúlico, p-cumárico, voláteis; decomposição de partes da clorogênico e caféico planta no solo; extratos
E. citriodora óleos voláteis, cineol, limoneno voláteis; decomposição de partes da
planta no solo.
E. globulus óleos voláteis; limoneno; cineol; ácidos voláteis; lixiviados e decomposição de
clorogênico, ferúlico, p-cumárico, cafeico, folhas gálico e elágico; taninos e monoterpenos
E. microtheca alfa pireno, campfeno e cineol; ácidos voláteis e lixiviados
clorogênico, ferúlico, p-cumárico e caféico
E. regnans terpenóides e fenóis exsudados da raiz; solo
E. teraticornis fenóis e terpenos extratos
E. viminalis ácidos gentisico, elágico, sináptico e caféico; folhas, lixiviado e decomposição de
agliconas fenólicas; glicosídeos e partes da planta. terpenóides
184 Ferreira e Aquila
com possível efeito alelopático e distribuição da curva germinativa. Foi encontrado que extratos aquosos de folhas de Mimosa bimucronata ( DC) OK. inibiam a germinação de algumas espécies de hortícolas, e que este efeito dependia da época do ano em que as folhas fossem coletadas (Tabela 7) e da espécie alvo (Jacobi e Ferreira, 1991). Muitas vezes o efeito alelopático não é sobre a germinabilidade (percentual final de germinação no tempo, segundo Labouriau, 1983), mas sobre a velocidade de germinação ou outro parâmetro do processo, como pode ser visto na Figura 3 (Borghetti e Pessoa, 1997; Rodrigues et al. , 1999). O efeito alelopático pode provocar alterações na curva de distribuição da germinação, que passa de distribuição normal para uma curtose, nas situações mais simples (Figura 4a), até distribuições erráticas, alongando a curva através do eixo do tempo (Figura 4b) ou um padrão complexo de distribuição de germinação das sementes, devido ao ruído informacional (Labouriau e Agudo, 1987). Desta forma, o acompanhamento da germinação deve ser diário ou em tempos mais curtos que 24 horas. Estas alterações no padrão de germinação podem resultar de efeitos sobre: a permeabilidade
de membranas; a transcrição e tradução do DNA; o funcionamento dos mensageiros secundários; a respiração, por seqüestro de oxigênio (fenóis); a conformação de enzimas e de receptores, ou ainda pela combinação destes fatores. Os efeitos dos aleloquímicos sobre o crescimento da plântula, usando como substrato papel de filtro, são, em geral, muito mais drásticos, como se pode observar no caso das mesmas culturas acima mencionadas (Tabela 8). A incorporação de frutos de Ilex paraguariensis (erveira ou erva-mate) ao solo (não apenas extratos) também produziu efeitos significativos em vários parâmetros de crescimento do milho, mesmo após 60 dias de incorporação do material no solo (Tabela 9). Interessante observação foi realizada por Weidenhamer et al. (1987), que notaram uma redução no efeito alelopática quando um número maior de plântulas foi colocado na placa. O aumento do volume da substância alelopática nulificou este efeito, ou seja, o crescimento das radículas de Cucumis sativus foi proporcional ao fitotóxico disponível para cada semente. Portanto, deve-se cuidar da proporção entre o aleloquímico e o material biológico em teste.
TABELA 7 - Efeito de extratos aquosos de folhas de Mimosa bimucronata em duas concentrações sobre a germinação de 6 espécies hortícolas. Dados em percentual dos controles. Adaptado de Jacobi e Ferreira (1991).
Época do ano Concentração g Cultura folhas/ml água Alface Arroz Cenoura Chicória Repolho Tomate primavera 01:08 100 100 94 102 96 104 01:04 100 99 90 90 102 103 verão 01:08 91 99 93 85 100 82 01:04 73* 100 69* 72* 93 46** outono 01:08 79* 105 97 83 103 97 01:04 61** 101 75* 62** 105 37** inverno 01:08 91 103 95 105 105 81* 01:04 67** 101 65** 75** 98 36** Significativamente diferente do controle ao nível de 5% () ou 1% (*).
Alelopatia: Uma Área ... 185
FIGURA 3 - Percentuais de germinação acumulada de sementes de Mimosa bimucronata no extrato (ext) das folhas desta espécie na concentração osmótica de -0,156 MPa. Observe-se que, após 90 horas, a germinabilidade é estatisticamente igual. Adaptado de Astarita et al. (1996).
TABELA 8 - Efeito de extratos aquosos de folhas de Mimosa bimucronata sobre o crescimento da radícula de 6 espécies hortícolas. Dados em mm, depois de 5 dias de exposição. Adaptado de Jacobi e Ferreira (1991).
Época do Cultura ano
Concentração g folhas/ml água (^) Alface Arroz Cenoura Chicória Repolho Tomate
Primavera controle 28,0 a 42,6 a 38,3 a 26,9 a 42,2 a 82,0 a 01:08 16,4 b 28,1 b 22,2 b 17,4 b 26,0 b 33,1 b 01:04 11,4 c 18,4 c 17,3 c 12,1 c 10,8 c 25,1 c Verão controle 30,9 a 47,8 a 40,9 a 30,4 a 37,8 a 87,9 a 01:08 12,5 b 20,7 b 18,2 b 15,0 b 11,6 b 27,0 b 01:04 6,5 c 11,0 c 9,4 c 8,0 c 4,1 c 11,0 c Outono controle 27,7 a 45,9 a 38,8 a 29,9 a 36,7 a 87,1 a 01:08 13,8 b 18,0 b 19,1 b 20,6 b 9,3 b 19,4 b 01:04 5,1 c 9,0 c 8,2 c 6,6 c 3,6 c 15,9 c Inverno controle 29,9 48,8 a 30,1 a 29,7 a 35,6 a 83,9 a 01:08 12,9 b 17,7 b 17,4 b 15,5 b 7,3 b 15,9 b 01:04 3,2 c 8,7 c 6,7 c 7,9 c 3,4 c 8,7 c Análise por época do ano e cultura. Letras iguais na coluna indicam diferenças não significativas pelo teste SNK.
0
20
40
60
80
100
0 24 32 40 48 56 64 72 84 92 100 Tempo (horas)
Germinação (%) Controle Ext. (-0,156 MPa)
a a
Alelopatia: Uma Área ... 187
FIGURA 4 - Germinação, em percentuais não acumulados, de sementes de Mimosa bimucronata. a) Curtose é bem nítida em NaCl em concentração equivalente a -0,414 MPa. Adaptado de Rodrigues et al. (1999). b) Germinação no extrato (ext) das folhas desta espécie na concentração osmótica de -0, MPa. Observe-se que os dados do controle tem distribuição próximos da normal, enquanto no extrato, além do retardo no inicio da germinação, a curva de distribuição não se aproxima da normal.
0
10
20
30
40
50
60
0 24 32 40 48 56 64 Tempo (horas)
Germinação (%) - não acumulada
(^) Controle
(-0,156 MPa) (-0,414 MPa)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
16 24 32 40 48 56 64 72 84 92 100 Tempo (horas)
Germinação (%) - não acumulada
(^) Controle Ext. (-0,156 MPa)
188 Ferreira e Aquila
FIGURA 5 - Percentuais de alongamento de plântulas de Mimosa bimucronata em diferentes potenciais osmóticos provocados por PEG 6000, depois de 90 horas de tratamento. Adaptada de Astarita et al. (1996).
TABELA 10 - Efeito de extratos aquosos de folhas de Mimosa bimucronata ou de PEG 6000* o sobre o crescimento de plântulas desta espécie, após 96 horas de tratamento. Adaptado de Astarita et al. (1996).
Comprimento (cm) Tratamento Plântula Radícula Hipocótilo Controle 6,56a 3,20a 3,29a
PEG (-0,158 MPa 5,63b 2,84b 2,72b
Extrato 1:8 (p/v) 2,93c 1,13c 1,82c
PEG (-0,414 MPa) 5,71b 3,79d 1,90c
Extrato 1:4 (p/v) 2,34d 0,85c 1,39d
Nas colunas, valores com a mesma letra indicam diferenças não significativas (LSD de 5%).
- PEG 6000 - Poli-etileno glicol, que pode ter moléculas maiores ou menores. Os mais usuais são PEG 4000; 6000; 8000.
y = -2,4x + 55, R^2 = 0,
y = 2,4229x + 44, R^2 = 0,
40
44
48
52
56
60
64
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0, Potencial osmótico (-MPa)
Comprimento (% da plântula)
Raiz Parte aérea
190 Ferreira e Aquila
FIGURA 6 - Mudanças diárias no conteúdo de alcalóides na planta de Papaver somniferum. Adaptado de Waller et al. (1999).
Morfina - média diária = 4,93%
0
50
100
150
200
1 5 9 13 17
Codeina - média diária = 0,72%
0
100
200
300
1 5 9 13 17
Teobromina - média diária = 0,51%
0
50
100
150
1 5 9 13 17
Codeina
Teobromina
Morfina Conteudo de Alcalóides Expresso como % Média Diária
Alelopatia: Uma Área ... 191
À parte dos fatores que afetam a produção de aleloquímicos e sua liberação no ambiente, outros aspectos importantes da alelopatia incluem sua absorção, translocação no organismo receptor, enfim, sua efetividade como aleloquímico; uma vez esclarecidos, trarão importante contribuição para a compreensão deste fenômeno. Dos milhares de compostos naturais identificados a cada ano, que ocorrem nas plantas, nos microorganismos e no solo, poucos tem sido estudados para seu uso potencial. A complexidade bioquímica e de comportamento fisiológico entre espécies ainda é pouco compreendida (Waller et al. , 1999). A colaboração entre cientistas bem treinados em áreas como espectrometria de massa e ressonância magnética, capazes de identificar substâncias em misturas de compostos, poderia ajudar em muito os pesquisadores interessados em alelopatia.
NITROGÊNIO E OUTROS ELEMENTOS - INTERAÇÃO COM O SOLO
As plantas terrestres estão fixadas ao solo de onde retiram, além de água, a maior parte dos nutrientes minerais. Para estas plantas, os aleloquímicos provêem de restos de plantas vizinhas (advindos de folhas, flores, frutos e pólen que formam a serrapilheira) e de compostos lixiviados pela ação da chuva sobre as copas e troncos. Podem vir também dos exsudados das raízes. Os aleloquímicos são transformados pela ação dos microrganismos e por vários organismos que vivem no estrato superior do solo (minhocas, insetos, fungos, etc.). Na serrapilheira em degradação e na camada superficial do solo logo abaixo dela, onde convivem comunidades multivariadas, há por parte dos microrganismos uma grande demanda de N. A relação entre o C de matéria carbonada e nitrogênio é aproximadamente C:N 30:1 (Reinhardt et al. , 1999). Isto pode levar a uma deficiência temporária de N disponível para as
plantas devido à alta atividade e quantidade de microrganismos que utilizam este elemento para seu próprio metabolismo, formando uma cadeia de eventos que pode ser resumida da seguinte maneira: moléculas orgânicas -› alta atividade de microrganismos -› privação temporária de nitrogênio -› crescimento limitado das plantas (Dakshini et al. , 1999). Isto não é efeito alelopático. De outra parte, os aleloquímicos podem influir sobre a atividade destes decompositores, especialmente sobre bactérias dos gêneros Nitrosomonas , que oxidam amônia a nitrito, e Nitrobacter , que oxidam nitrito a nitrato (Rice, 1984). Há evidências que a baixa concentração de nitratos em áreas clímax é, muitas vezes, devido à inibição alelopática da nitrificação (Rice, 1992). Finalmente, deve-se mencionar que meta- bólitos secundários inertes sob o ponto de vista alelo- pático podem ser ativados pela ação dos decom- positores, tornando-os ativos (Waller et al. , 1999). Compostos fenólicos inibiram o crescimento de fixadores de nitrogênio dos gêneros Azotobacter sp., Enterobacter sp. e Clostridium sp. (Rice, 1992). Estes compostos também influenciam no acúmulo e disponibilidade de fosfato, uma vez que eles competem pelos sítios de absorção nas micelas das argilas (Dakshini et al. , 1999). A textura e composição do solo, como decorrência do acima exposto, têm influência no efeito alelopático. Em solos arenosos, há menor adsorção que nos solos coloidais, e, neste caso, os aleloquímicos liberados seriam mais efetivos, por ficarem livres, na fase aquosa do solo (Inderjit e Dakshini, 1995).
INTERFERÊNCIA, COMPETIÇÃO E ALELOPATIA
O termo interferência deve ser usado como o efeito de uma planta sobre a outra, incluindo alelopatia e competição (Muller, 1969).
Alelopatia: Uma Área ... 193
METODOLOGIAS E BIOENSAIOS
Conforme foi visto até aqui, há inúmeros fatores que influem para se estabelecer o fenômeno de alelopatia. Os ensaios que comprovem, ou pelo menos tentem comprovar, tais efeitos são bastante variáveis diante destas dificuldades.
Germinação de sementes em laboratório
Os testes de germinação são simples a serem realizados, no entanto, há uma série de cuidados que devem ser tomados para que se possa ter respostas reproduzíveis. Os testes podem ser realizados em laboratório a temperatura ambiente, porém, como a temperatura influi sobre a germinação, o controle desta é desejável. O uso da temperatura entre 22 e 28 oC é o procedimento mais comum. Outro cuidado é que as placas não sequem. A colocação de duas ou três folhas de papel filtro ou absorvente no fundo da placa diminui o problema. Colocar algodão sob o papel ou fina camada de esponja neutra desinfestada pode ser uma boa alternativa. O uso de ágar-gel também é uma possibilidade interessante, mas neste caso, o gel deve ser de boa qualidade para que este não acrescente mais fontes de interferência. Deve ser evitado o alagamento das placas de forma que as sementes boiarem. O uso de películas plásticas vedando as tampas das placas ou caixas gerbox também auxilia. Por último, a colocação de uma ou mais vasilhas com água no interior da câmara pode evitar problemas de secamento das placas. Deve-se alertar que a evaporação dos extratos tornam-nos mais concentrados, o que pode falsear os resultados. As sementes teste podem ser de espécies que se encontrem no local a campo. Como as espécies nativas, amiúde, possuem algum tipo de dormência, o uso de sementes de espécies cultivadas, de boa qualidade, é aconselhável. Tomate e alface são duas espécies em que as “sementes” (alface é um aquênio) são facilmente encontradas e bastante sensíveis a vários aleloquímicos.
A germinação deve ser verificada diariamente ou até de 8 em 8 horas, para contabilizar as sementes germinadas. O critério deve ser do aparecimento da curvatura geotrópica da radícula ou o seu tamanho ser no mínimo 50% do tamanho da semente, para evitar falsa germinação por expansão do embrião com a embebição (Labouriau, 1983). Muitas vezes, o possível alelopático apenas retarda o processo germinativo (Figura 3). Tomate e alface, em geral, germinam em 72 horas, dependendo da temperatura. A análise da velocidade, taxa e comportamento da curva acumulada de germinação, pode dar indicações importantes sobre o alelopático. O controle do pH e da concentração osmótica dos extratos brutos é fundamental, pois pode haver neles substâncias como açúcares, aminoácidos e ácidos orgânicos que influem no pH e são osmoticamente ativos.
Germinação em casa de vegetação ou canteiro
Areia lavada (que tem menor interação com as substâncias testes) ou solo, ambos esterilizados, são utilizados, mas fumigações devem ser evitadas para estudos de alelopatia. Então, ao utilizar substrato natural sem esterilização, se deve assumir que há uma dinâmica de transformações no solo difícil de acompanhar e de reproduzir. A germinação será acompanhada pela emergência da plântula na superfície do substrato, uma vez que a semente é enterrada. Neste caso, se houver dormência regida pela luz, deverá haver um pré- tratamento para sua quebra. Aliás, quaisquer tipos de dormência eventualmente existentes devem ser quebrados antes do teste de alelopatia. Usando-se vasos ou canteiros, dois procedimentos mais usuais são seguidos: 1- adicionar o material que se suspeita tenha o alelopático, incorporando-o ao substrato; 2 - lixiviar o material repetidas vezes, obtendo-se assim um percolado que contem o(s) aleloquímico(s). Na Figura 7 tem-se um modelo
194 Ferreira e Aquila
usado para extrações de aleloquímicos (Chou, 1999). O lixiviado também pode ser obtido de plantas vicejando em vasos, conforme pode ser visto na Figura 8 (Friedman e Waller, 1985). Quando o aleloquímico é volátil, ele pode ser testado usando-se o procedimento de colocar o material em frascos menores, dentro de um frasco maior, o qual será tampado, após colocar- se placas forradas com um substrato úmido com as sementes dos bioensaios. Os volátil(eis) liberado(s) poderá(ão) influir então na germinação (Chou, 1999). Dois procedimentos não são recomendados: macerar o material com suspeita de alelopatia, pois se pode estar liberando substâncias que não estariam ativas fosse o processo natural observado, com queda no solo e desidratação gradativa do material (Inderjit e Dakshini, 1995); também deve ser evitada a extração com solventes orgânicos (clorofórmio, éter, álcool, etc.), pois na natureza isto não ocorre e poder-se-ia estar liberando compostos que em condições naturais não atuariam alelopaticamente (Inderjit, 1996).
Crescimento
A emergência da plântula e seu crescimento são as fases mais sensíveis na ontogênese do indivíduo (Blum, 1999). Massa seca da raiz ou parte aérea, bem como o comprimento das plântulas ou radículas, são os parâmetros mais usados para avaliar o efeito alelopático sobre o crescimento (Jacobi e Ferreira, 1991; Inderjit e Dakshini; 1995; Pratley et al. , 1999). A quantidade de pêlos absorventes (Tabela 12) também é um parâmetro muito sensível, particularmente em milho, onde eles são muito conspícuos (Meguro, 1969; Miró et al. , 1998). Os testes podem ser feitos seguindo os procedimentos expostos para a germinação, desde que, naqueles de laboratório, alguns cuidados sejam observados rigorosamente; como não deixar
secar ou concentrar muito, pela evaporação, os extratos em teste. Placas de petri tem a restrição de ter pouca altura, e como a parte aérea tem gravitropismo negativo, seu desenvolvimento pode ser limitado pela tampa da placa. É interessante, quando se testa extratos, não fazer a germinação neles, colocando as sementes para germinar previamente em água destilada, e só depois transferindo as plântulas que tiverem um certo tamanho de radícula, por exemplo 5 mm, para a solução teste. Com isto, pode-se uniformizar a amostra e obter resultados dos efeitos alelopáticos mais uniformes, o que facilita as análises pela diminuição da variabilidade, além de se poder ter amostras do mesmo tamanho.
Testes em meio aquoso
A maioria das plantas de interesse econômico são angiospermas terrestres. As interações das plantas no meio terrestre com o substrato são difíceis de seguir e testar. Assim, foram propostos alguns testes em meio líquido, sob vários aspectos experimentais, mais fáceis de manipular e analisar. A principal vantagem é de o(s) aleloquímico (s) já estarem no meio aquoso, sem a necessidade de liberação de complexos com a matriz do solo. Alface é a planta mais comum como espécie alvo para examinar alelopatia entre as hidrófitas, devido tanto ao pequeno período requerido para sua germinação (24 a 48 horas) quanto para seu crescimento (Elakovich, 1999). As reservas que a semente de alface possui, no entanto, não permitem um desenvolvimento expressivo da plântula sem uso de nutrientes externos, o que é uma limitação. Por outro lado, oferece uma vantagem extra, de poder ser cultivada em soluções hidropônicas, o que pode ser manejado para exploração de algum problema de alelopatia. Einhellig e colaboradores (1985) usaram a aquática flutuante Lemna minor L., que
