Microscopia
Disciplina de BIOLOGIA CELULAR
Carlos M. G. Reis
2003
ESCOLA SUPERIOR AGRÁRIA
INSTITUTO POLITÉCNICO DE CASTELO BRANCO
Laboratório de Biologia Vegetal
Disciplina de BIOLOGIA CELULAR
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Apontamentos Microscopia, Notas de estudo de Agronomia
Apontamentos de microscopia. Microscopia ótica e eletrónica. Conceitos base.
Tipologia: Notas de estudo
2014
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Microscopia
Disciplina de BIOLOGIA CELULAR
Carlos M. G. Reis
ESCOLA SUPERIOR AGRÁRIA
INSTITUTO POLITÉCNICO DE CASTELO BRANCO Laboratório de Biologia Vegetal Disciplina de BIOLOGIA CELULAR
Índice
- Introdução 2
- Unidades de medida utilizadas em microscopia 2
- Microscopia óptica 3 3.1 Partes constituintes do microscópio óptico 3 3.2 Ampliação 4 3.3 Poder de Resolução 5 3.4 Utilização da objectiva de imersão 7 3.5 Outros tipos de microscópios ópticos 8
- Microscopia electrónica 9 4.1 Microscópio electrónico de transmissão (TEM) 11 4.2. Microscópio electrónico de varrimento ou de exploração ( scanning , SEM)
- Preparação de material biológico para observação em microscopia 17 5.1. Fixação 17 5.2 Inclusão 17 5.3 Corte ou microtomia 18 5.4 Coloração 19 5.5 Montagem 19 Bibliografia 20 Anexo: Utilização do microscópio óptico
Agradecimento: Agradecimento muito especial à Eng.ª Maria Leopoldina V. Rosa, Prof. Adjunto da ESACB, pela leitura e revisão deste documento.
3. Microscopia óptica Os microscópios ópticos possuem lentes ópticas, existindo vários tipos, nomeadamente: (1) microscopia luminosa, (2) de campo escuro, (3) de ultravioleta, (4) de fluorescência e (5) de contraste de fase. Na microscopia óptica de campo luminoso, da qual se falará com maior detalhe, o campo do microscópio aparece brilhantemente iluminado e os objectos estudados apresentam-se mais escuros.
3.1. Partes constituintes do microscópio óptico O microscópio óptico (fig. 1) é constituído por um sistema óptico e um sistema mecânico. O sistema óptico compõe-se de três sistemas de lentes (ocular, objecticas e condensador) e uma fonte de luz. O sistema mecânico é constituído pela estrutura que suporta os elementos do sistema óptico, e inclui os elementos de focagem.
Fig. 1 – Partes constituintes do microscópio óptico. A - elementos do sistema óptico; B – elementos do sistema mecânico.
A finalidade do condensador é a de projectar um cone de luz uniforme sobre o objecto. Após a passagem pelo objecto, o feixe penetra na objectiva. A objectiva projecta uma imagem aumentada, no plano focal da ocular, que novamente a amplia. O olho vê uma imagem virtual, ampliada e invertida do objecto (fig. 2).
Tubo ( B ) Braço ou coluna ( B )
Lente objectiva ( A ) Parafuso micrométrico ( B ) Parafuso macrométrico ( B )
Base ou pé (B)
Lente do condensador e comando do diafragma ( A )
Platina ( B )
Revólver ( B )
Lente ocular ( A )
Sistema de iluminação ( A )
Em anexo (Anexo 1) encontra-se informação acerca da utilização do microscópio luminoso e cuidados a ter no seu manuseamento.
3.2. Ampliação A ampliação total é dada pela combinação de lentes do microscópio; é igual ao produto das ampliações individuais das objectivas e da ocular. Assim, por exemplo, se a ampliação da objectiva é 100x e a amplição da ocular 10x, a ampliação total será 1000x. Os valores das ampliações individuais são normalmente indicados nas lentes, pelo fabricante (fig. 3).
Fig. 3 - Aspecto de algumas inscrições existentes nas lentes objectivas.
Abertura numérica
Espessura da lamela (mm) a utilizar
Ampliação da objectiva Comprimento do tubo (mm)
Fig. 2 – Esquema da formação da imagem num microscópio óptico. AB
- objecto adequadamente iluminado e colocado sobre a platina; A’B’ – imagem real e invertida, formada ao nível do foco da ocular; A’’B’’ – imagem captada na retina do observador (na realidade forma-se uma imagem virtual no infinito); F – foco da objectiva; fobj – distância focal da objectiva; foc – distância focal da ocular. (Adaptado de Mello & Vidal, 1980).
O limite de resolução é directamente proporcional ao comprimento de onda da radiação utilizada e inversamente proporcional à abertura numérica da objectiva. O comprimento de onda de luz utilizado nos microscópios de campo luminoso é limitado. A luz visível varia entre 400 e 700 ηm (nanómetros); para efeitos de cálculo é utilizado o valor de 550 ηm (0,55 μm), comprimento de onda que corresponde à radiação na banda do amarelo verde e para a qual o olho humano apresenta maior sensibilidade. Para diminuir o limite de resolução é necessário utilizar luz de pequeno comprimento de onda ou então utilizar objectivas de maior abertura numérica. Em qualquer dos casos, existem dificuldades intransponíveis. No que se refere ao comprimento de onda, a radiação ultra-violeta apresenta valores cerca de 300 ηm (0,3 μm), o que permite melhorar quase duas vezes o poder resolvente (para cerca de 0,1μm). É esta a ideia base que esteve no desenvolvimento do microscópio de ultravioleta. Contudo existem dificuldades práticas associadas à utilização deste tipo de radiação. Como o vidro não transmite o ultravioleta é necessário utilizar lentes de quartzo. Outra limitação associada reside no facto de não ser possível fazer a observação directa das imagens, pelo que a imagem deve ser registada fotograficamente. Como instrumento de alta resolução o microscópio de ultravioleta é superado pelo microscópio electrónico, sendo utilizado sobretudo em citoquímica, já que certos componentes celulares, como os ácidos nucleicos, absorvem selectivamente luz ultravioleta de comprimento de onda específico. Quanto à abertura numérica, esta é característica de cada lente objectiva (fig. 3) e a possibilidade de alteração das objectivas microscópicas, capaz de aumentar a abertura numérica, é limitada; o maior valor de A.N. conseguido para as objectivas a seco é menor que 1 (0,95), e as objectivas de imersão têm um valor de AN apenas ligeiramente superior a 1 (1,2 a 1,4) (tabela 1). O valor mínimo de L.R. para um microscópio óptico, considerando uma grande abertura numérica (1,4), com o máximo de correcção de aberrações e iluminação correcta, é de cerca de 0,2 μm. No caso dos microscópios do laboratório de Biologia, utilizando uma objectiva de imersão com um valor de AN de 1,25, o melhor que se consegue, teoricamente, é um limite de resolução de 0,27 μm.
LR = 0 , 6110 ,, 2555 = 0 , 27 μ m
Tabela 1 - Abertura numérica das objectivas e limite de resolução conseguido com os microscópios utilizados nas aulas práticas de Biologia Celular.
Características Lentes objectivas “a seco”
Objectiva de imersão Ampliação da objectiva 4x 10x 40x 100x Ampliação total^2 40x 100x 400x 1000x Abertura numérica 0,10 0,25 0,65 1, Limite de resolução (μm) 3,36^ 1,34^ 0,52^ 0, Distância entre objectiva e o espécimen (mm)
29,0 6,30 0,53 0,
3.4. Utilização da objectiva de imersão Esta objectiva é usada com o óleo de imersão interposto entre a lâmina de vidro e a objectiva. É a objectiva que exige maiores cuidados na sua utilização, pois foca muito próximo do material a observar. Como foi referido, o limite de resolução é inversamente proporcional à abertura numérica
da objectiva, sendo este valor calculado por AN = n x sen α. Como o valor de α não
excede na prática 72º (sen 72 = 0,95), o valor máximo da abertura numérica com uma objectiva a seco é 0,95, já que para o ar n = 1,0. O valor do índice de refracção é assim especialmente importante na determinação da abertura numérica. A vantagem de utilizar o óleo de imersão é que este possui um índice de refracção de 1,5 o qual é semelhante ao do vidro (tabela. 2). Tal evita a dispersão dos raios luminosos quando atravessam o conjunto lâmina-óleo, permitindo a entrada de um grande cone de luz na objectiva (fig. 5). Como foi referido conseguem-se valores de LR próximos de 0,2 μm.
Tabela 2 - Valores do índice de refracção para diferentes meios. Em microscopia, varia entre 1, (para o ar) e 1,5 (para o óleo de imersão).
Material Índice de Refracção Ar 1. Água 1. Glicerol 1. Óleo de imersão 1. Vidro 1. Diamante 2.
(^2) Assumindo que a ampliação da lente ocular é de 10x
Microscópio de fluorescência Fluorescência é a propriedade de algumas substâncias para, após serem excitadas com radiação de baixo comprimento de onda, emitirem radiação de maior comprimento de onda. Algumas substâncias absorvem a energia da radiação ultravioleta emitindo depois radiação dentro do espectro de luz visível. Microorganismos corados por um corante fluorescente aparecem como objectos luminosos quando observados com luz ultravioleta. É com recurso a esta técnica que se evidenciam, por exemplo, os antigenes quando associados a anticorpos acoplados a moléculas fluorescentes. Os fluorocromos são conjugados com anticorpos, sendo possível identificar células individuais que reagem com o anticorpo (aplicação designada de imunofluorescência).
Microscópio de ultravioleta Já se fizeram algumas referências a este tipo de microscópio em parágrafos anteriores (ver 3.3). A radiação utilizada é o ultravioleta que tem um comprimento de onda perto de 0,2 a 0,3 μm, inferior ao valores de λ para a luz visível, o que permite melhorar o limite de resolução comparativamente ao microscópio de campo luminoso. A óptica é constituída por lentes de quartzo já que o vidro não transmite este tipo de radiação.
4. Microscopia electrónica Como foi referido o poder de resolução do microscópio óptico está limitado pela abertura numérica e pelo comprimento de onda da radiação. Não sendo possível aumentar a
Figura 6 - Aspecto de células vivas observadas com microscópio óptico de campo luminoso ( a ) e microscópio óptico de contraste de fase ( b ).
abertura numérica, a solução passou pela utilização de radiação de menor comprimento de onda (λ). Em 1924 Louis de Broglie, um físico francês, demonstrou que os electrões têm propriedades ondulatórias, à semelhança da luz visível, ultravioleta e raios x. O comprimento de onda de um electrão em movimento depende da sua velocidade e esta da energia de aceleração que lhe é imprimida. O comprimento de onda de um electrão é dado por:
m v
λ = h
Nesta fórmula λ representa o comprimento de onda, h é a constante de Planck (6,62559 x
10 -34^ J.s-1), m é a massa da partícula e v a velocidade da partícula. Os electrões podem ser acelerados por uma diferença de potencial, sendo a velocidade directamente proporcional a essa diferença de potencial (tabela 3).
Tabela 3. Comprimento de onda de um electrão em função da diferença de potencial aplicada Diferença de potencial (V) λ - Comprimento de onda ( η m) 150 0, 50 000 0, 100 000 0, 1 000 000 0,
Para efeitos de cálculo, valores aproximados para o comprimento de onda dos electrões podem ser obtidos pela seguinte fórmula:
V
λ =^1 ,^5
onde V é a diferença de potencial em volts.
Electrões acelerados por diferença de potencial de 50 000 a 100 000 volts têm um comprimento de onda cerca de 100 000 vezes menor que o da luz visível. Graças ao reduzido valor de λ é possível aumentar o poder de resolução. O limite de resolução do microscópio electrónico de transmissão atinge 0,4 a 0,5 ηm (excepcionalmente 0,2 ηm) o que representa, relativamente ao microscópio óptico, um poder resolvente cerca de 500 vezes maior. Em objectos biológicos o limite de resolução situa-se perto de 1 ηm (10 Å).
Para além do canhão electrónico, a coluna é constituída por uma ou mais lentes condensadoras, uma lente objectiva, uma ou mais lentes intermediárias (sem correspondente no microscópio óptico e que servem para variação da ampliação), uma lente projectora, um porta objectos em platina móvel que é controlado do exterior, um écran (por vezes dois), uma câmara fotográfica e outros dispositivos que não serão mencionados dada a complexidade do aparelho (fig. 9). As lentes do microscópio electrónico são de natureza electromagnética, sendo constituídas por uma bobine, formada por milhares de voltas de fio, através da qual passa uma corrente eléctrica. Enquanto que no microscópio óptico a focagem da objectiva faz-se pelo deslocamento mecânico da lente ou do objecto, no microscópio electrónico a focagem é feita por variação da corrente que passa na bobine, a qual afecta a distância focal da objectiva. A variação da ampliação é feita por variação da distância focal das lentes intermédias.
Fig. 9 – Aspecto da coluna do microscópio electrónico de transmissão (TEM); A - Secção da coluna (Philips, EM 200); B – Aspecto exterior (Leo, Libra 120).
A
B
Os objectos que se pretendem estudar, resultantes de cortes ultra-finos, são colocados sobre uma pequena grelha metálica circular de diâmetro reduzido (3 mm). São as modificações que os electrões experimentam ao atravessar esses cortes, isto é a dispersão que sofrem, que nos dão a imagem final. A dispersão dos electrões ocorre em função da espessura e da densidade molecular do objecto e depende, em especial, do número atómico dos átomos que entram na sua composição. Quanto maior for o número atómico, maior é a dispersão. Como grande parte dos átomos que constituem as estruturas biológicas têm número atómico baixo e contribuem pouco para a formação da imagem, adicionam-se átomos pesados à estrutura molecular, para aumentar o contraste. Como o olho humano não é sensível aos electrões, a imagem é visualizada num écran fluorescente ou então registada em película fotográfica. À semelhança do microscópio óptico a imagem obtida é bidimensional; na fig. 10 é possível visualizar a ultra-estrutura de uma mitocôndria observada ao TEM.
Um aspecto importante é que a coluna do microscópio electrónico tem de estar em alto vácuo para impedir a colisão dos electrões com os átomos do ar. Uma bomba de vácuo assegura um vazio de menos 5 atm. O microscópio de electrónico de transmissão assemelha-se, na disposição dos seus elementos, a um microscópio óptico invertido. Este paralelismo pode ser observado na fig.
- As tabelas 4 e 5 permitem comparar os dois tipos de microscópios, óptico e electrónico, para um conjunto de características.
Fig. 10 – Aspecto da ultra-estrutura mitocondrial observada ao TEM, com ampliação de 60 000 x.
Tabela 5 – Comparação entre diferentes tipos de microscopia (adaptado de Pelzcar et al ., 1980).
Tipo de microscopia
Ampliação total Aspecto do objecto Exemplos de aplicações
Campo luminoso 1000 – 2000 x^ Objectos corados ou não; as bactérias, geralmente coradas, assumem a cor do corante
Determinação dos elementos morfológicos grosseiros de bactérias, leveduras, fungos, algas, protozoários
Campo escuro 1000 – 2000 x^ Geralmente não corados; o objecto aparece brilhante ou “iluminado” sobre um fundo escuro
Microorganismos que exibem algum dado morfológico característico em estado vivo e em suspensão líquido (ex. espiroquetas)
Ultravioleta 1000 – 2000 x^ Não é possível a visualização directa; fotografado
Diferenciação de componentes celulares, com base em maior ou menor absorção da luz ultravioleta
Fluorescente 1000 – 2000 x^ Brilhante e corado; cor do corante fluorescente
Técnicas de diagnóstico, nas quais o fluorocromo fixado ao organismo revela a sua identidade
Contraste de fase 1000 – 2000 x^ Vários graus de “brilho” Exame de estruturas celulares em células vivas de microorganismos como leveduras, algas, protozoários e algumas bactérias
Electrónica (TEM) 200 000–400 000 x^ Observação em écran fluorescente
Exame de vírus e da ultra- estrutura celular
4.2. Microscópio electrónico de varrimento ou de exploração ( scanning , SEM) Os microscópios electrónicos de varrimento foram comercializados pela primeira vez em 1965, sendo extremamente úteis em determinadas áreas da pesquisa biológica. O principal aspecto deste tipo de microscópio é que um feixe de electrões extremamente fino é utilizado para varrer o objecto. Resultam daí vários efeitos, nomeadamente a emissão de electrões secundários, isto é, electrões livres do objecto são ejectados em consequência do impacto dos electrões do feixe. Os electrões secundários emitidos pelo
objecto são recolhidos por um tubo fotomultiplicador e a imagem é formada num écran de televisão. Frequentemente o objecto é coberto com uma fina película metálica no sentido de favorecer a emissão de electrões secundários. A fig. 12 mostra o aspecto exterior de um microscópio electrónico de varrimento. O microscópio electrónico de varrimento pode ser utilizado numa amplitude larga de ampliações, variando desde 10 a 100 000x o que permite uma grande plasticidade na sua utilização. Acresce o facto de apresentar uma grande profundidade de focagem o que permite estudar a topografia da superfície de objectos sólidos e obter imagens tridimensionais (fig. 13). Relativamente ao limite de resolução, este depende de vários factores, sendo o mais importante o diâmetro do feixe de electrões no ponto de impacto com o objecto. Na prática, em condições favoráveis, conseguem-se valores de cerca de 10 ηm para o limite de resolução. Os microscópios electrónicos de transmissão e varrimento diferem nas suas propriedades. No primeiro caso (TEM), o objectivo principal centra-se em obter valores muito baixos para o limite de resolução, pelo que a sua utilização está vocacionada para o estudo da ultra-estrutura celular. Aqui os objectos a observar são resultado de cortes ultra-finos, sendo difícil obter informação sobre estruturas a 3 dimensões. No segundo caso (SEM), é possível obter informação detalhada sobre a topografia da superfície de objectos sólidos, e obter imagens tridimensionais.
Fig. 13 – Aspecto tridimensional de uma diatomácea observada com SEM (ampliação 5000x).
Fig. 12 – Aspecto exterior de um moderno microscópio electrónico de varrimento (SEM) (Leo).
Os meios de inclusão mais usados (parafina e resinas do tipo epoxi) não são miscíveis com a água, pelo que, após a fixação, o material biológico é sujeito a uma desidratação, normalmente pelo álcool ou pela acetona. A parafina é utilizada a quente (cerca de 60ºC) e solidifica pelo arrefecimento, formando blocos que permitem efectuar cortes com alguns micra de espessura. Não permite contudo a realização de cortes com espessura inferior a 0,1 μm (< 100 ηm), pelo que não é um meio de inclusão adequado para microscopia electrónica. Quando se utilizam resinas é frequente proceder-se depois à substituição do álcool por uma mistura da resina de inclusão, isto é, faz-se uma infiltração inicial. Em microscopia electrónica utilizam-se as resinas do tipo epóxi, como a Araldite e Epon, que permitem formar um bloco extremamente sólido o qual suporta cortes de apenas algumas dezenas de nanómetros de espessura.
5.3 Corte ou microtomia Para haver formação de imagem no microscópio é necessário que o material biológico se deixe atravessar pela luz, no caso do microscópio óptico, ou pelos electrões, no caso do microscópio electrónico. Assim, torna-se necessário proceder ao corte do material biológico para que isso seja possível. Os cortes são executados em aparelhos designados micrótomos. Nalguns micrótomos o bloco está fixo e a navalha é móvel, noutros a navalha é fixa e é o bloco que se movimenta (fig. 14).
Os micrótomos possuem navalhas extremamente afiadas que permitem efectuar cortes muito finos. Em microscopia óptica as navalhas são de aço e permitem efectuar cortes com alguns micra de espessura (5 a 10 μm); em microscopia electrónica os cortes são
Fig. 14 – Aspecto de micrótomo do tipo “rotativo”, de navalha fixa.
extremamente finos, cerca de 20 a 100 ηm, utilizando-se micrótomos com navalhas de vidro ou de diamante.
5.4 Coloração A maioria dos elementos que constituem os tecidos biológicos é naturalmente incolor, apresentando pouco contraste, pelo que é difícil a sua observação. Assim, no sentido de evidenciar determinadas estruturas celulares, os cortes são corados por diferentes substâncias antes de se proceder à montagem definitiva. A maioria dos corantes comporta-se como base ou ácido. Nos corantes básicos, o grupo químico responsável pela cor ou cromóforo, é catiónico (isto é, apresenta carga positiva). Os grupos cromóforos destes corantes combinam-se com os grupos ácidos ou aniónicos (que apresentam carga negativa) das moléculas celulares. Moléculas ácidas como o DNA, que apresenta carga eléctrica negativa conferida pelos grupos fosfato, têm afinidade com este tipo de corantes. O azul de metileno, o azul de toluidina e a hematoxilina são exemplos de corantes básicos. Nos corantes ácidos o grupo cromóforo é aniónico (apresenta carga negativa) e ocorre a combinação com os componentes celulares básicos (que têm carga positiva). Exemplos de corantes ácidos são a eosina e a fucsina ácida. Os cortes para microscopia electrónica de transmissão são colocados sobre uma pequena grelha e sofrem uma contrastação, a qual consiste na deposição, sobre certas estruturas, de átomos de elementos de número atómico elevado (normalmente chumbo, urânio ou tungsténio) os quais apresentam grande poder para dispersar electrões.
5.5 Montagem Consiste na colocação do material biológico fixado, desidratado, incluído, cortado e corado, entre uma lâmina e uma lamela de vidro. A montagem pode ser permanente se os cortes forem colocados na lâmina numa resina (por exemplo bálsamo do canadá ou entellan) que, depois de colocada a lamela, solidifica e permite conservar a preparação. No caso da microscopia electrónica esta fase não existe uma vez que o material, após ser contrastado, é observado de imediato e fotografado, sendo as fotografias o registo definitivo das estruturas biológicas em estudo.