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Eletroforese em gel de agarose e espectrofotometria
Tipologia: Manuais, Projetos, Pesquisas
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Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri
Departamento de Farmácia Disciplina: Biologia Molecular
Docente: Michaelle Geralda Santos
Discentes: Alissane Ingrith Silva
Julia Gabriela Moreira
Diamantina, 03 de maio de 2019.
1.1 Eletroforese em gel de agarose
A análise de DNA por eletroforese é uma das técnicas fundamentais nos laboratórios de pesquisa e de diagnóstico. O princípio é baseado no fato da molécula de DNA possuir carga negativa em valores de pH neutro ou alcalino e consequentemente, quando aplicado ou imerso em uma matriz de gel submetida a um campo elétrico, migra em direção ao pólo positivo (anôdo).
O tipo de matriz que é usada (agarose ou poliacrilamida) depende do tamanho dos fragmentos de DNA que se pretende separar e visualizar. Apesar de ser mais efetivo para separar fragmentos pequenos, o gel de poliacrilamida apresenta algumas desvantagens. Entre elas, destaca-se o fato da poliacrilamida em solução, isto é, quando não polimerizada, ser neurotóxica. Assim, a preparação do gel exige certa cautela. Além disso, a preparação é mais laboriosa, requerendo a mistura de componentes adicionais à poliacrilamida para ajudar na polimerização e mais tempo para que a polimerização ocorra propriamente. Já o gel de agarose é feito apenas através da mistura de um tampão e agarose, não apresentando toxicidade. A polimerização é mais rápida e o gel pode ser reciclado após o uso, isto é, pode ser reutilizado na elaboração de outros géis. Além disso, a eletroforese em gel de agarose pode ser usada como método analítico ou preparativo, isto é, quando o fragmento de DNA é recuperado e purificado a partir do gel.
Entretanto, dependendo do método utilizado para a visualização do DNA, o gel de agarose pode ser desvantajoso. Frequentemente se utiliza a coloração com brometo de etídio (EtBr), uma substância mutagênica. Em adição, para a visualização do DNA corado com EtBr, é necessária a utilização de transiluminador de luz ultravioleta. Para a utilização de tal aparelho e para a o uso do brometo de etídio, é necessário o cuidado com a biossegurança não somente do manipulador, mas de todos os que compartilham o uso do laboratório.
A agarose é um polissacarídeo (como ágar e pectina) que dissolve em água fervente e consequentemente se gelifica quando esfria assim como uma gelatina. Para realizar uma eletroforese, o gel de agarose é preparado, o DNA é introduzido em pequenos poços de gel, e então uma corrente elétrica é aplicada através do gel.
3.1. Eletroforese em gel de agarose
Materiais:
Amostras: DNA de fungo filamentoso; DNA de leucócitos do sangue e DNA plasmidial
Erlenmeyer
Pipeta automática
Ponteiras estéreis
Microtubos de 1,5 ml
Banho maria 68ºC
Microondas
Cuba de eletroforese
Corante de corrida Blue juice
Tampão TE pH 8
Tampão TAE
EDTA 0,5 M pH
3.1.2 Metodologia
Em algumas aulas praticas anteriores foi realizado a extração do DNA (de fungo, leucócitos do sangue e plasmidial) para que fosse possível realizar essa eletroforese.
Primeiramente verificou que todas as peças da cuba de eletroforese estivessem limpas e a montou, conferiu-se a não existência de desnível e que a cuba estivesse equilibrada e sobre uma superfície horizontal.
Preparou-se o tampão TAE em quantidade suficiente para todas as etapas em que ele seria usado, o que correspondeu cerca de 30 mL com uma diluição de 50x, e em uma proveta colocou-se 30 mL do tampão e completou-se com água ate atingir a marca.
Em seguida preparou-se a solução de agarose a 1%, pesando 0,3g de agarose e misturou-se com 30 mL do tampão feito anteriormente e levou a um micro- ondas até que toda a agarose estivesse completamente dissolvida, o tempo médio de dissolução foi de aproximadamente 1min30seg, sendo que de 30 em 30 segundos retirou-se o erlenmeyer para uma leve agitação.
Deixou-se que o gel esfriasse a uma temperatura de aproximadamente 60°C e adicionou-se o brometo de etídio (Blue juice) (1μg/μL) e misturou agitando cuidadosamente.
Verteu-se a agarose na bandeja tomando todo o cuidado necessário para evitar a formação de bolhas e se caso acontecesse, deveria ser retirada com auxilio de uma ponteira, imediatamente após a versão do gel colocou-se o pente para que ocorra a formação dos poços.
Enquanto a polimerização do gel acontecesse, preparou-se as amostras colocando cerca de 5μL de Blue juice, 10 μL de amostra e 10 μL de água e aqueceu-se por 2 minutos em banho-maria a uma temperatura de 68°C. (As amostras foram identificadas como : L1, L2( leucócitos); P1, P2 e P3 ( plasmidio); F1, F2 e F3(fungos)).
Aguardou-se a completa polimerização da agarose e retirou-se o pente com os cuidados necessários para que o gel se mantivesse íntegro e transferiu-se o gel para a cuba de eletroforese e adicionou-se o tampão feito no inicio da prática (TAE) na cuba de forma que cobrisse todo o gel.
Com as amostras prontas e o gel já polimerizado e como tampão, aplicou-se as amostras tomando todo o cuidado para que não fosse aplicado para fora do poço, sempre lembrando que, ao aplicar, deve-se apertar apenas o primeiro estágio da ponteira e só soltar quando a ponteira estiver fora do ambiente (poço) onde está a amostra pois se soltar dentro do pocinho, estará sugando novamente a amostra.
É importante ressaltar que se deve anotar em uma folha anexa qual foi a ordem de aplicação das amostras para identifica-las após a corrida.
Conectou-se os fios na cuba e na fonte de energia, verificou-se se estava corretamente colocados, lembrando que a amostra deve ficar no polo negativo. Ligou-se todo o aparato de eletroforese a uma voltagem de 100 V e deixou-se por cerca de 20 minutos.
Desligou-se a corrente e usou-se o corante revelador e colocou-se apenas o gel, sem a sua bandeja no transiluminador, colocou-se a tampa protetora e examinou o gel.
vermelho alaranjado (590nm). Os grupos de moléculas de mesmo tamanho que migram na matriz de agarose assumem a forma do poço e constituem as formas chamadas de bandas de DNA. Com este método foi possível detectar uma certa quantidade de DNA e a intensidade de fluorescência emitida foram proporcionais à concentração de DNA que estava presente na amostra.
Lembrando que o blue juice, corante de corrida utilizado é de grande ajuda para que se possa vê a olho nu a que ponto se encontra a corrida quando o gel está no aparato de corrida, pois se não utilizasse esse gel, a amostra de interesse iria correr muito e poderia até mesmo sair completamente do gel de agarose. Com a aplicação desse gel isso não acontece, o pesquisador consegue ver em que ponto está à corrida e interromper quando estiver por satisfeito e for suficiente para analise.
Ao revelar o gel de agarose, pode-se observar que não ouve a presença do DNA, pode- se explicar essa não aparição do DNA de duas formas:
Na figura 1 é possível observar uma fotografia da eletroforese em gel de agarose, a nitidez da imagem compromete bastante, mas pode-se observar que as amostras d fungos e dos plasmídeos não houve formação de uma banda como o esperado, pode ter ocorrido uma degradação. Já as amostras dos leucócitos mostrou a formação de uma banda dentro do esperado.
Figura SEQ Figura * ARABIC 1: Resultado da eletroforese em gel de agarose
4.2 Espectrofotometria
O método de espectrofotometria foi utilizado para quantificar a concentração de DNA existente nas soluções preparadas.
Os resultados obtidos pelo espectrofotômetro estão enunciados nas seguintes tabelas:
✓ Média dos Brancos
Amostra 230nm 260nm 280nm Água 0, 1017 0,0482 0, 04445
✓ Média das Amostras
Amostra 230nm 260nm 280nm Fungos 0,4039 0,2789 0, Leucócitos 0,4946 0,3302 0, Plasmidios 0,8262 1,6914 0,
✓ Desconto do Branco
Amostra 230nm 260nm 280nm Fungos 0,3022 0,2307 0, Leucócitos 0,3929 0,282 0, Plasmídios 0,7245 1,6432 0,
✓ Calculos:
♦ 260/
Fungos: 0,2307 / 0,3022 = 0,
Leucócitos: 0,282 / 0,3929 = 0,
Plasmídios: 1,6432 / 0,7245 = 2,
Valores diferentes de 1,7 – 2,2 são indicativos de contaminantes
Possíveis contaminantes: sais e compostos orgânicos.
♦ 260/
Fungos: 0,2307 / 0,1738 = 1,
Leucócitos: 0,282 / 0,1411 = 1,
Plasmídios: 1,6432 / 0,7789 = 2,
