Manual de Produção e Controle de Qualidade de Produtos Biológicos com Bacillus, Manuais, Projetos, Pesquisas de Microbiologia

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Manual de produção e controle de qualidade

de produtos biológicos à base de bactérias do

gênero Bacillus para uso na agricultura

ISSN 0102 0110 Maio / 2020

DOCUMENTOS

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Ministério da agricultura, Pecuária e Abastecimento

Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Brasília, DF 2020

Manual de produção e controle de qualidade

de produtos biológicos à base de bactérias do

gênero Bacillus para uso na agricultura

Rose Monnerat Sandro Coelho Linhares Montalvão Erica Soares Martins Paulo Roberto Martins Queiroz Ester Yoshie Yosino da Silva Aline Rafaela Moura Garcia Marcelo Tavares de Castro Gabriela Teodoro Rocha Antônia Débora Camila de Lima Ferreira Ana Cristina Meneses Mendes Gomess

DOCUMENTOS 369

ISSN 0102- Maio/

Autores

Rose Monnerat

Bióloga, PhD em Patologia de Invertebrados, pesquisadora da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

Sandro Coelho Linhares Montalvão

Engenheiro Agrônomo, PhD em Fitopatologia

Erica Soares Martins

Bióloga, PhD em Biologia Molecular

Paulo Roberto Queiroz

Biólogo, PhD em Biologia Animal

Ester Yoshie Yosino da Silva

Engenheira de Alimentos, PhD em Ciências da Saúde

Aline Rafaela Moura Garcia

Bióloga, PhD em Entomologia

Marcelo Tavares de Castro

Engenheiro Florestal, PhD em Agronomia

Gabriela Teodoro Rocha

Engenheira Florestal, mestre em Produção Vegetal

Antônia Débora Camila de Lima Ferreira

Engenheira Agrônoma, mestre em Fitotecnia

Ana Cristina Meneses Mendes Gomes

Bióloga, mestre em Ciências Agrárias, analista da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

Sumário

• 1. Introdução ...................................................................................................................................................
• 2. Objetivo
• 3. Bactérias do gênero Bacillus utilizadas em controle biológico de pragas e doenças agrícolas
  • 3.1 Bacillus thuringiensis
  • 3.2 Bacillus subtilis ....................................................................................................................................
  • 3.3 Bacillus pumilus ....................................................................................................................................
  • 3.4 Bacillus amyloliquefasciens ..................................................................................................................
  • 3.5 Bacillus licheniformis ............................................................................................................................
  • 3.6 Bacillus methylotrophicus .....................................................................................................................
• 4. Produção e formulação de produtos
  • 4.1 Estrutura física
  • 4.2 Meios de cultura para produção em larga escala.................................................................................
  • 4.3 Coleção de trabalho – material biológico ............................................................................................
  • 4.4 Cultivo dos microrganismos em escala ...............................................................................................
• 5. Controle de qualidade de bioprodutos ........................................................................................................
  • 5.1. Procedimento para identificação morfológica das bactérias ...............................................................
  • 5.2. Procedimento para determinação de pH ............................................................................................
  • 5.3 Procedimento para determinação do número de unidades formadoras de colônias (UFC) ...............
  • 5.4. Procedimento para avaliação da eficácia de produtos para controle de lagartas
  • 5.5. Procedimento para avaliação da presença de beta exotoxinas
  • 5.6. Procedimento para determinação de contaminantes
• 6. Agradecimentos
• 7. Literatura Recomendada
• Anexo 1: Lista de reagentes
• Anexo 2: Material de laboratório......................................................................................................................
• Anexo 3: Meio Embrapa Líquido
• Anexo 4: Meio Embrapa Sólido
• Anexo 5: Dieta artificial para lagartas

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1. Introdução

O Brasil é um país de clima tropical, cuja economia está intimamente ligada à agri- cultura. Esta condição climática é extremamente favorável ao cultivo de diversas culturas durante todo o ano. Contudo, a produtividade agrícola é constantemente ameaçada por inú- meros fatores abióticos e bióticos, dentre os quais estão as pragas e doenças. A ausência de invernos rigorosos, a abundância de água e luz condicionam a ocorrência massiva des- sas pragas e doenças, fazendo com que o país seja um dos líderes mundiais em consumo de agrotóxicos, fato este duramente criticado por muitos mercados internos e externos.

Uma alternativa viável para o controle de pragas e de doenças é o controle biológico. Ele é definido como o uso de organismos vivos para suprimir a população de uma praga ou doença específica, tornando-a menos abundante ou menos danosa. Trata-se de um fenô- meno natural, pois quase todas as espécies têm inimigos naturais que regulam suas popu- lações. Tem sido utilizado desde o século III, quando os chineses observaram que formigas podiam controlar pragas dos citros. Muitos anos mais tarde, em 1888, os Estados Unidos iniciaram o uso de Rodolia cardinalis , um besouro originário da Austrália para controlar o pulgão branco dos citros, Icerya purchasi. O trabalho foi pioneiro e tão bem-sucedido que a Califórnia é considerada o berço do Controle Biológico no mundo. No Brasil, a primeira introdução de um agente de controle biológico aconteceu em 1921, quando um parasi- tóide, Encarsia berlesei , foi utilizado para controlar a cochonilha-branca-do-pessegueiro, Pseudaulacaspis pentagona. A partir de 1970 o tema controle biológico começou a fazer parte dos estudos de entomologia e o conceito de manejo integrado de pragas começou a ser implementado.

Segundo a ABCBio (Associação Brasileira das Empresas de Controle Biológico), ins- tituição criada em 2007 para congregar as empresas produtoras e comerciantes de produ- tos biológicos para controle de pragas, atualmente Crop Life, o mercado de biodefensivos no Brasil está estimado em US$ 95,6 milhões (1% do mercado de agrotóxicos) e a taxa de crescimento anual prevista é de 20%. Em 2021, o mercado deverá ser de US$ 237,8 mi- lhões. Comparada à indústria de agrotóxicos convencionais, a indústria de biocontrole está crescendo 5,3 vezes mais rápido.

O Brasil está acompanhando a tendência de mercado mundial, inclusive com o apoio governamental, a exemplo de outros países. Um levantamento internacional destaca que o Brasil é o quarto país com melhor desempenho na produção de bioprodutos, respondendo por 7% da comercialização mundial. Entretanto, o setor biológico é liderado pelos Estados Unidos (37%), Espanha (14%) e Itália (10%).

Dentre os fatores que podem explicar o rápido crescimento do mercado de biopro- dutos, destacam-se: (1) o custo de desenvolvimento de um produto biológico, estimado em 2 a 10 mil dólares, comparado ao químico com custo estimado em 250 mil dólares, (2) a especificidade dos agentes de controle biológico que atuam apenas no alvo, (3) a susten- tabilidade do método por apresentar menor impacto ambiental e aos seres vivos, além de não ser poluente, (4) a seleção de pragas resistentes aos produtos químicos e aos cultivos transgênicos, (5) a baixa probabilidade de seleção de insetos resistentes aos agentes de controle biológico, e (6) a exigência do mercado consumidor, preocupado com os efeitos adversos dos produtos químicos e seus resíduos.

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Figura 1 – Esporos e inclusões proteicas cristalinas bipiramidais de B. thuringiensis. (a) microscopia de contraste de fase, (b) microscopia eletrônica de varredura.

As vantagens da utilização de B. thuringiensis são a especificidade aos organismos susceptíveis, o efeito não poluente ao meio ambiente, a inocuidade aos mamíferos e inver- tebrados e ausência de toxicidade às plantas.

Bacillus thuringiensis produz diferentes tipos de toxinas: as δ-endotoxinas, α-exotoxina, β-exotoxina, VIP (vegetative insecticidal proteins) e SIP (secreted insecticidal proteins). As mais utilizadas são as toxinas Cry, que estão no cristal produzido pela bactéria durante a fase de esporulação. Essas toxinas têm um amplo espectro de ação, sendo tóxicas a insetos de diversas ordens. As toxinas VIP e SIP são produzidas na fase de crescimento vegetativo e atuam sobre insetos das ordens Lepidoptera e Coleoptera. A α-exotoxina apresenta atividade citolítica e é toxica a ratos e outros vertebrados, e a β-exotoxina, por apresentar efeito teratogênico e mutagênico, não deve ser utilizada como base de produtos comerciais. Além destas, algumas estirpes podem produzir moléculas bioestimuladoras e biofertilizadoras, como fitohormônios, proteínas solubilizadoras de fosfato e sideróforos além de proteínas parasporinas, as quais exibem atividade citotóxica específica contra células cancerígenas de humanos.

A ação das toxinas Cry se inicia após a sua ingestão pelos insetos. Os sintomas de intoxicação são a perda do apetite e o abandono do alimento, paralisia do intestino, vômito, diarreia, paralisia total e, finalmente, a morte. As larvas perdem sua agilidade e o tegumento adquire tonalidade de cor marrom-escura. Após a morte, a larva apresenta cor negra, ca- racterística das infecções provocadas por este microrganismo.

No Brasil, segundo dados do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) – Agrofit, existem no mercado vinte e cinco produtos/formulações comerciais à base de B. thuringiensis para o controle de pragas agrícolas: Able, Agree, Bac-Control Max EC, Bac-Control WP e Bac-Control Max WP, BTControl, BT-Turbo Max, Costar, Crystal, Dipel, Dipel ES-NT, Dipel WG, Dipel WP, Helymax EC, Helymax WP, Javelin WG, Ponto Final, Stregga EC, Super-Bt, Tarik EC, Tarik WP, Thuricide, Thuricide SC, Winner Max EC e Xentari. Estes produtos comerciais têm como princípios ativos as estirpes B. thuringiensis subsp. kurstaki e B. thuringiensis subsp. aizawai , que são utilizados no controle de lagartas, como Helicoverpa armigera (lagarta-do-algodão), Anticarsia gemmatalis (lagarta da soja)

Figura: Ana Cristina Gomes

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Spodoptera frugiperda (lagarta-do-cartucho), Tuta absoluta (traça-do-tomateiro) e Plutella xylostella (traça-das-crucíferas).

Existem duas cepas de Bacillus thuringiensis descritas na Especificação de Referência do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), (Especificação de referência de números 28 e 34).

3.2 Bacillus subtilis ....................................................................................................................................

Bacillus subtilis é uma bactéria móvel que forma esporos centrais com formato ci- líndrico ou elipsoidal (Figura 2). As colônias podem ter diferentes colorações, variando do esbranquiçado ao preto, a depender do meio de cultura empregado.

Bacillus subtilis é encontrada principalmente no solo e na rizosfera, o que proporcio- na proteção contra vários agentes causadores de doenças em plantas. O grande interesse nessa espécie bacteriana consiste nos inúmeros metabólitos secundários que ela produz, podendo ser utilizada no âmbito agrícola e medicinal. Além disso, essa bactéria é capaz de produzir biofilmes que proporcionam uma colonização preventiva e benéfica para as raízes de inúmeras plantas.

Figura 2 – Esporos e células vegetativas de B. subtilis. (a) microscopia de contraste de fase, (b) microscopia eletrônica de varredura.

Existem seis produtos registrados no MAPA à base de B. subtilis para controle de fun- gos, bactérias e nematoides: Rizos®, RizosOG® e Biobaci® (bionematicidas); Bio-Imune® e Biobac® (biofungicidas); e Serenade® (biofungicida e biobactericida).

Existe uma cepa de Bacillus subtilis descrita na Especificação de Referência do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), (Especificação de referência de número 25).

3.3 Bacillus pumilus ....................................................................................................................................

Bacillus pumilus é uma bactéria formadora de esporos (Figura 3), encontrada em vários tipos de ambientes, como solo (principalmente), água, ar e tecidos vegetais em de- composição. Essa bactéria é amplamente utilizada em processos industriais, fabricação de alimentos fermentados, tratamento de água e de ambientes contaminados.

Figura: Ana Cristina Gomes

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Existe uma cepa de Bacillus amyloliquefasciens descrita na Especificação de Referência do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), (Especificação de referência de número 37).

3.5 Bacillus licheniformis ............................................................................................................................

Bacillus licheniformis é uma bactéria móvel que forma esporos na porção sub- terminal ou no centro da célula com formato elipsoidal a cilíndrico (Figura 5). A coloração da colônia em meio de cultura normalmente é esbranquiçada e possui formato arredondado a irregular.

Bacillus licheniformis não causa doenças em plantas, tem sido extensamente utilizada na medicina humana e veterinária como probióticos e na produção de detergentes. É muito eficaz para controlar nematoides. Estudos mostram que a mistura entre B. licheniformis e B. subtilis promoveu o crescimento de plantas de soja.

Figura 5: Células vegetativas e esporos do B. licheniformis. (a) microscopia de contraste de fase, (b) microscopia eletrônica de varredura.

Ainda não existe um produto comercial exclusivo à base de B. licheniformis dispo- nível no mercado. Os produtos Presence® e Quartzo® são nematicidas biológicos que contém uma mistura entre B. subtilis e B. licheniformis com múltiplos mecanismos de ação.

3.6 Bacillus methylotrophicus .....................................................................................................................

Bacillus methylotrophicus é uma bactéria encontrada na rizosfera e apresenta gran- de potencial de promoção de crescimento de plantas. B. methylotrophicus é aeróbica, mó- vel, com endósporos em formato de bastão (Figura 6).

O grande interesse nessa espécie bacteriana consiste justamente na sua interação benéfica com plantas, promovendo o seu crescimento. Além disso, produz bacteriocinas, possui capacidade de biorremediar solos e age no controle de doenças.

Figura: Ana Cristina Gomes

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Figura 6: Células vegetativas e esporos do B. methylotrophicus. (a) microscopia de con- traste de fase, (b) microscopia eletrônica de varredura.

Existem dois produtos registrados no MAPA à base de B. methylotrophicus , ambos para controle de nematoides: Onix® e OnixOG® ( Pratylenchus brachyurus e Meloidogyne javanica ).

Existe uma cepa de Bacillus methylotrophicus descrita na Especificação de Referência do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), (Especificação de referên- cia de número 27).

4- Produção e formulação de produtos

Para que os produtos biológicos sejam feitos com qualidade é necessário dispor de: (1) estrutura física adequada, contendo equipamentos e insumos de boa qualidade, (2) meio de cultura adequado, (3) coleção de trabalho contendo os microrganismos bem iden- tificados e preservados e (4) metodologia de produção bem estabelecida.

4.1 Estrutura física

Recomenda-se que a estrutura física de uma unidade de produção seja composta minimamente por 4 áreas: a) área de utilidades; b) área de fermentação; c) área de esto- que de insumos e d) área de armazenamento de produto acabado. É importante contar com um laboratório de controle de qualidade (e), podendo este ser na própria propriedade terceirizado.

a - Área de utilidades: A área de utilidades pode-se restringir a uma cobertura sob a qual se disponham equipamentos que dão suporte a unidade de produção. No caso da produção ser realizada em fermentador, os equipamentos devem ser: um gerador de vapor, compres- sor de ar e sistema de resfriamento (torre de resfriamento e/ou água gelada).

b - Área de fermentação: ambiente destinado ao (s) reator (es) ou outro equipamento se- melhante para produção dos microrganismos.

Figura: Ana Cristina Gomes

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4.2 Meios de cultura para produção em larga escala.................................................................................

Para cultivar as bactérias do gênero Bacillus , é fundamental dispor de um meio de cultura adequado. Os meios de cultivo para essas bactérias geralmente possuem uma fonte de nitrogênio (extrato de caseína, caseína hidrolisada, peptona), outra de carbono (glicose, dextrose, amido) e sais minerais (micro e macro elementos). Algumas vezes se adicionam ao meio alguns tampões (fosfato) e antiespumantes a fim de facilitar o processo. A fonte de carbono, além de fornecer matéria prima para muitos compostos celulares, serve como fonte de energia. O nitrogênio é requerido principalmente para síntese de proteínas e ácidos nucléicos. Os sais minerais atuam como cofatores e são também importantes no controle da osmolaridade celular. Existem diversos meios de cultura disponíveis no mer- cado. É recomendável conhecer a procedência e qualidade dos mesmos, pois muitas em- presas comercializam meios de cultura fabricados a partir de resíduos ou subprodutos que apresentam variação nos teores de carboidratos e proteínas entre diferentes lotes. Desta forma, o produto final resultante poderá apresentar diferentes rendimentos e consequente- mente eficácia.

4.3 Coleção de trabalho – material biológico ............................................................................................

Para o correto funcionamento de uma biofábrica, a qualidade dos microrganismos (material biológico) é fundamental. O primeiro passo é dispor de uma “Coleção de trabalho”. Para isso, bactérias do gênero Bacillus podem ser multiplicadas e armazenadas em tiras de papel filtro, a partir de uma estirpe pura conforme procedimento abaixo:

4.3.1- Multiplicação de Bacillus

As estirpes puras de Bacillus , armazenadas em papel de filtro ou por outro método de preservação, devem ser multiplicadas por meio de inoculação em um erlenmeyer de 125 mL contendo 40 mL do meio Embrapa líquido (Anexo 3) em capela de fluxo laminar previamente limpa com álcool 70% e esterilizada por 20 min em luz UV. Em seguida, as amostras inoculadas devem ser colocadas para crescer em incubador rotativo a 200 rpm, 28 ± 4°C por 72 horas (até a completa esporulação). Depois de 72 horas, as amostras de- vem ser identificadas morfologicamente e testadas quanto à pureza.

4.3.2- Identificação dos Bacillus

Para a identificação morfológica, as amostras contidas no erlenmeyer devem ser analisadas em microscópio de contraste de fase com aumento de 1000x. Para isso, deve- -se levar o erlenmeyer para a capela de fluxo laminar previamente limpa com álcool 70% e esterilizada por 20 min em luz UV. Com uma micropipeta ou pipeta estéril, colocar uma gota da bactéria em lâmina e cobrir com uma lamínula. Adicionar uma gota de óleo de imersão sobre a lamínula e realizar a visualização das amostras sob microscópio.

As principais características que devem ser checadas no microscópio de contraste de fase são: célula vegetativa, forma e posição do esporo, motilidade e no caso

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do B. thuringiensis , também, a presença de corpos paraesporais/cristais. As informações referentes a cada espécie do gênero Bacillus estão especificadas na Tabela 1.

Tabela 1: Características morfológicas visualizadas no microscópio contraste de fase dos principais bacilos utilizados na agricultura.

As amostras viáveis deverão apresentar esporos. No caso de Bacillus thuringiensis deve ser considerada também a presença de cristais. Caso a amostra apresente células vegetativas, esporângios ou ausência de esporos e cristais será considerada não viável, pois ao final de 72 horas, todas devem apresentar estas características (Figura 7).

Figura 7: Microscopia de contraste de fase de esporos e cristais de Bacillus thuringiensis (a) e esporos e esporângios do B. licheniformis (b)

4.3.3 - Testes de pureza

Para confirmar a pureza, as amostras devem ser semeadas em forma de estrias, com uma alça estéril, em placas contendo meio Embrapa sólido (Anexo 4) (Figura 8). Em seguida, devem ser fechadas com filme plástico e incubadas em estufa de crescimento à temperatura de 30 ± 4°C por 72 horas.

Características morfológicas

B.thuringiensis B.amyloliquefaciens B.lichiniformes B. subtilis B.methilotrophicus B. pumillus

Largura da célula vegetativa (μm)

1-1, (Largo)

0,7-0,9^1 Estreito

0,6-0, (Estreito)

0,7-0, (Estreito)

0.63–0.64 2 (Estreito)

0,6-0, (Estreito) Comprimento da célula vegetativa (μm

3- (célula pequena a grande)

1,8-3,0^1 (célula pequena)

1,5- (célula pequena)

2- (célula pequena)

1.8–2.7 2 (célula pequena)

2- (célula pequena) Forma do esporo Elíptico, lembrando grão de feijão

Elípticos, mais alongados

Elíptico, quase cilíndricos

Elíptico,mais arredondado

Tipo um bastonete curto Elíptico,mais arredondado e pequeno Posição do esporo Subterminal Central Subterminal Subterminal Central Subterminal Presença de cristais Presente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Motilidade Presente Presente Presente Presente Presente Presente

Figura: Ana Cristina Gomes

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Caso os dois testes comprovem a identidade e pureza das bactérias, elas podem ser preservadas.

4 - Preservação das amostras de Bacillus

Inicialmente deve-se separar todo o material necessário para a preservação das bactérias: Papel mata borrão, tubos criogênicos de 5,0 mL, pinças de inox com ponta ser- rilhada reta, placas de Petri em vidro, papel pardo, fita crepe, béquer de plástico de 2. mL, papel alumínio e liga elástica.

Cortar as tiras de papel filtro Mata Borrão (0,3 cm de largura x 2,0 cm de comprimen- to) e colocar aproximadamente 50 tirinhas em cada uma das placas de Petri. Embrulhar as placas e as pinças com papel pardo e fita crepe. Preparar os tubos criogênicos, colocan- do-os dentro do béquer de plástico de 2 L, fechar com papel alumínio e, por cima, colocar papel pardo e fechar com liga elástica. Identificar e marcar todos os materiais com fita de autoclave. Esterilizar em autoclave a 120 ºC por 20 min. Após a esterilização, retirar da au- toclave os materiais e colocar em estufa de secagem (40 - 50ºC) por no mínimo 2 dias ou até que todo material esteja seco.

Para realizar a preservação, limpar a capela de fluxo laminar com álcool 70%, co- locar todo material dentro da capela e esterilizar os materiais por 20 min em luz UV. Em seguida, desligar a UV e ligar a luz branca, acender o bico de Bünsen, desembrulhar as placas de Petri, identificar as placas com o número das amostras e iniciar o processo de preservação. Flambar a pinça e transferir as tiras de papel filtro previamente esterilizadas para os erlenmeyers contendo as bactérias crescidas. Deixar os papéis-filtro imersos por no mínimo meia hora (30 minutos) nas soluções bacterianas. Decorrido o tempo de imersão, transferir as tiras de papéis-filtro de cada erlenmeyer, com uma pinça flambada para suas respectivas placas de Petri de vidro, espalhando as tiras uma a uma ao longo das placas. Deixá-las secar por cerca de 5 horas em capela de fluxo laminar (ligada) com ambas as luzes desligadas.

Depois de secas (observar se as tiras soltam facilmente das placas) e transferi-las para os tubos criogênicos, colocando quatro tiras por tubo (Figura 10). Em seguida, identi- ficar os tubos criogênicos com o n° das amostras e a data da preservação. Deixar na placa pelo menos duas tiras de papel para serem utilizadas no teste de pureza. Semear as tiras em meio Embrapa sólido, guardar as amostras, enquanto aguarda o resultado do teste.

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Figura 10: Etapas para a preservação de amostras de Bacillus spp.: (1) adicionar as tiras de papel filtro no erlenmeyer contendo as estirpes cultivadas, (2) deixar as tiras de papel de filtro imersas por 30 minutos, (3) coletar as tiras de papel embebidas, (4) depositar as tiras em placas de Petri, (5) espalhar as tiras de papel e deixar secar por cerca de 5 horas, (6) transferir as tiras de papel para os tubos criogênicos e (7) armazenar 4 tiras de papel por tubo criogênico.

5 - Testes de pureza Pós-armazenamento

As amostras devem ser semeadas em placas de Petri, previamente identificadas, contendo meio Embrapa sólido. Para isso, deslizar as tiras de papel de filtro, com auxílio da pinça flambada no meio Embrapa sólido (Anexo 4). Em seguida, fechar as placas com filme plástico e incubar em estufa de crescimento a temperatura de 30 ± 4°C por 72 horas. Todo procedimento deverá ser realizado no interior de capela previamente limpa com álcool 70% e esterilizada sob luz UV por 20 min.

Decorridas as 72 horas, as amostras semeadas em meio Embrapa sólido (Anexo 4) devem ser analisadas com relação ao crescimento bacteriano, consideradas puras (amos- tra com uma única cor e aspecto) e com ausência de contaminantes, devem ser etiquetadas e armazenadas a temperatura ambiente de até 28°C, em armário apropriado, compondo a “Coleção de Trabalho” (Figura 11).

Figura 11: Coleção de trabalho de estirpes de Bacillus spp. (a) material em tubos criogênicos guardados em caixas de papel identificadas, (b) Armário para estocar as caixas de papel (Coleção de trabalho)

Foto: Ester Silva

Foto: Lilian Praça