Esquema para cromatografias | Esquemas Farmácia

Fitoquímica

Métodos Cromatográficos

Cromatografia

Classificação dos métodos analíticos

• Clássicos: métodos de via úmida

- Gravimetria; - Volumetria;

• Instrumentais: baseados em propriedades físicas,

químicas em alguns casos.

o Eletroanalitíco:

▪ Propriedades elétricas;

o Espectrométrico:

▪ Propriedades ópticas;

o Cromatográfico:

▪ Propriedades mistas;

CROMATOGRAFIA

Conceito: É um conjunto de técnicas utilizadas para

separar diferentes compostos químicos de uma

mistura através de uma diferença de interação dos

seus componentes entre duas fases:

- Fase estacionária: Fase que se mantém fixa;

- Fase móvel: Fase que transporta as amostras através

da fase estacionária;

- Quantificação: uso de padrões;

- Objetivo da separação:

Analítica: informações relacionadas ao perfil

cromatográfico dessa amostra;

Preparativa: Onde ocorre realmente uma

separação;

→ Método físico-químico de separação dos

componentes de uma mistura realizada através da

distribuição desses componentes em duas fases:

estacionária e móvel. Ocorrendo a migração

diferencial desses componentes e consequentemente a

separação dos mesmos dependendo de suas

características químicas.

→ Michael Tswett – 1906, criou o termo

cromatografia, quando realizou um experimento com

a clorofila passando por carbonato de cálcio em pó e

como fase móvel o éter de petróleo e assim observou

bandas separadas e de cores distintas. Cromatografia

não se limita apenas a separação de cores.

→ Áreas de aplicação:

Indústria alimentos e farmacêutica; Q. forense;

Petroquímica; Bioquímica; Q. orgânica; Farmacologia;

Análises clínicas;

Classificação

As técnicas cromatográficas podem ser classificadas

dependendo da natureza física das fases, da técnica

empregada e dos fenômenos físico-químicos.

• Técnica:

L = líquido, S = sólido, FL= fase ligada.

o Critério: polaridade relativa das fases:

- em gasosa: fase móvel é inerte (“gás de arraste”);

- em líquida:

▪ A fase móvel tem que ter afinidade com os

compostos que se deseja separar, para que

promova interações químicas suficientemente

forte para quebrar as interações feitas com a

Técnica

Planar

Em coluna

Fase Móvel

Líquido

Gás

Fluído

supercrítico

Líquido

Fase

Estacionária

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Fitoquímica

Métodos Cromatográficos

Cromatografia

Classificação dos métodos analíticos

Clássicos: métodos de via úmida
- Gravimetria; - Volumetria;
Instrumentais: baseados em propriedades físicas, químicas em alguns casos. o Eletroanalitíco: ▪ Propriedades elétricas; o Espectrométrico: ▪ Propriedades ópticas; o Cromatográfico: ▪ Propriedades mistas;

CROMATOGRAFIA

Conceito: É um conjunto de técnicas utilizadas para separar diferentes compostos químicos de uma mistura através de uma diferença de interação dos seus componentes entre duas fases:

Fase estacionária: Fase que se mantém fixa;
Fase móvel: Fase que transporta as amostras através da fase estacionária;
Quantificação: uso de padrões;
Objetivo da separação: Analítica: informações relacionadas ao perfil cromatográfico dessa amostra; Preparativa: Onde ocorre realmente uma separação; → Método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura realizada através da distribuição desses componentes em duas fases: estacionária e móvel. Ocorrendo a migração diferencial desses componentes e consequentemente a separação dos mesmos dependendo de suas características químicas. → Michael Tswett – 1906, criou o termo cromatografia, quando realizou um experimento com a clorofila passando por carbonato de cálcio em pó e como fase móvel o éter de petróleo e assim observou bandas separadas e de cores distintas. Cromatografia não se limita apenas a separação de cores. → Áreas de aplicação: Indústria alimentos e farmacêutica; Q. forense; Petroquímica; Bioquímica; Q. orgânica; Farmacologia; Análises clínicas;

Classificação

As técnicas cromatográficas podem ser classificadas dependendo da natureza física das fases, da técnica empregada e dos fenômenos físico-químicos.

Técnica: L = líquido, S = sólido, FL= fase ligada. o Critério: polaridade relativa das fases:
- em gasosa: fase móvel é inerte (“gás de arraste”);
- em líquida: ▪ A fase móvel tem que ter afinidade com os compostos que se deseja separar, para que promova interações químicas suficientemente forte para quebrar as interações feitas com a Técnica Planar Em coluna Fase Móvel Líquido Gás Fluído supercrítico Líquido Fase Estacionária L S FL L S FL S FL L S FL

fase estacionária, assim, o eluente deve exercer uma força de eluição suficientemente forte para quebrar as interações feitas com a fase estacionária e por essa razão, a fase móvel e a amostra, devem possuir polaridades semelhantes. ▪ Fase normal (FE>FM) fase estacionária mais polar que a fase móvel: fase móvel (eluente) e matriz vegetal devem ser mais apolares, média ou baixa polaridade, pois se o eluente for mais polar não exercerá força de eluição suficiente para quebrar a interação da amostra com a fase estacionária; ▪ Fase Reversa (FM>FE) fase móvel mais polar que a fase estacionária: fase móvel e amostra devem ser mais polares , o Critério: mecanismo de separação processos:

Químicos: troca iônica, quiral, afinidade;
Físicos: sorção – adsorção ou absorção/partição;
Mecânicos: exclusão por tamanho molecular;
Mecanismos de separação: o Adsorção: Atrações eletrostáticas ou dipolares nas superfícies da fase estacionária sólida, pode ter fase normal ou reversa (geralmente em HPLC); o Partição: Diferenças de solubilidade entre os componentes da mistura e o líquido no suporte sólido – Cromatografia em papel; o Troca iônica: O íon da amostra se liga à carga fixa (grupo funcional) da fase estacionária; o Exclusão por tamanho: As moléculas são separadas por tamanho molecular; Princípios da Cromatografia → Separar → Identificar → Quantificar
Cromatografia Líquida o Fase móvel: é um líquido → eluente o Fase estacionária: é um sólido ou um líquido o Amostra: Substâncias dissolvidas no eluente que interagem com a fase estacionária, necessariamente precisam dissolver na fase móvel; o Principais tipos de adsorventes: ▪ Sílica – fase normal - polar
A sílica é uma das fases estacionárias mais utilizadas na cromatografia;
Baixo custo de fabricação;
Tamanho de partículas e custos variados;
maior e menos uniformes em relação as usadas no HPLC;
Contém grupos silanóis (-SiOH), que traz a característica polar;
Ideal para a separação de compostos apolares;
Muito usada para a separação de moléculas dissolvidas em solventes orgânicos apolares;
Desvantagens: é altamente higroscópica, adsorção irreversível com água e outras substâncias polares ;
Interação forte com certos grupos funcionais, pontes de H; ▪ Sílica – fase reversa - apolar
A sílica é modificada com cadeia carbônica ligada aos grupos silanóis;
Baixa interação com moléculas polares;

→ Insolubilidade na fase móvel; → Adsorção forte na fase estacionária; → Aplicação de quantidade muito grande da amostra o Coloca-se em uma cuba de vidro primeiramente o solvente para saturar os vapores e papel de filtro; o Solventes em ordem crescente de polaridade, ou seja, as manchas que saem primeiro são mais apolares e as que saem por último são mais polares; ▪ Reveladores, métodos que revelam substâncias incolores: Vapor de iodo; lâmpada de UV; reagente de Dragendorff; o Fator de retenção (Rf): ▪ Em condições experimentais bem definidas, uma substância percorre sempre uma distância fixa em relação à distância percorrida pelo solvente, facilitando a identificação de substâncias: 𝑅𝑓 = 𝐷𝑖𝑠𝑡â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑝𝑒𝑟𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑒𝑙𝑎 𝑚𝑎𝑛𝑐ℎ𝑎 𝐷𝑖𝑠𝑡â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑝𝑒𝑟𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑒𝑙𝑜 𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒 ▪ Quanto maior a distância percorrida maior o Rf e mais apolar será; o Vantagens: ▪ É uma técnica relativamente rápida; ▪ Baixo custo; ▪ Fácil compreensão e execução; ▪ Pode ter aplicação analítica ou preparativa; ▪ Versatilidade; o Aplicações na química: o Desvantagens: ▪ Técnica de difícil reprodutibilidade; ▪ Difícil estabelecer o Rf exato das substâncias; ▪ Pode haver perdas significativas da amostra; Cromatografia Líquida em Coluna

O processo cromatográfico acontece de forma manual;
Preparação da coluna e coleta das frações feitas pelo operador;
Mal empacotamento leva ao efeito de múltiplos caminhos;
Operam com diversos tipos de fases estacionárias: o Adsorção: Líquido-sólido: ▪ Interações diferenciais dos componentes com a fase estacionária; ▪ Função do eluente: conduzir a amostra pela coluna; o Exclusão molecular: ▪ Possui grânulos porosos: moléculas menores ficam presas e demoram mais a sair; o Partição; o Troca iônica; Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
Utilizada nas separações de misturas solúveis na fase móvel;
Não há limitação de volatilidade ou estabilidade térmica;
Diferenças entre a Cromatografia Liquida para CLAE:

Porque utilizar o CLAE:
- Alta versatilidade;
Fase móvel: o É reversa; o Fases móveis mais utilizadas: ▪ Água; ▪ Metanol; ▪ Acetonitrila; ▪ Clorofórmio; ▪ THF; ▪ Soluções tampão; o Características: ▪ Água altamente purificada; ▪ Certificar que é totalmente miscível; ▪ Solventes grau HPLC; ▪ Desgaseificar toda a fase móvel; ▪ Solução tampão preparado no momento do uso;
Equipamento: o Os componentes de um cromatógrafo líquido de alta eficiência são: ▪ Sistema de reservatório de fase móvel: O equipamento possui um desgaseificador do eluente, após essa etapa o solvente é levado a bomba que é programada anteriormente quanto a concentração dos solventes a serem utilizados ao longo do processo podendo ser isocrática ou por gradiente; ▪ Sistema de bombeamento de fase móvel; - Isocrática: aquela na qual a composição da fase móvel se apresenta constante durante todo o processo de análise, é realizada com um único solvente ou mistura constante de solventes; - Gradiente: possui a composição da fase móvel pode ser alternada durante a realização da análise. ▪ Sistema de injeção: Em seguida, o sistema de injeção que é responsável por introduzir a amostra de interesse no sistema para passar pela coluna; ▪ Sistema analítico que é constituído pela coluna cromatográfica; é utilizada uma pré-coluna que serve para proteger a coluna analítica como um escudo. A coluna fica em um forno, que é responsável por manter a temperatura da coluna e da fase móvel constante durante a separação. ▪ Sistema de detecção: O detector coleta os resultados e envia o sinal para o software que é convertido em cromatograma. ▪ Sistema de aquisição e registro de dados. o Para prolongar a vida útil do equipamento: ▪ Evitar choques mecânicos, contaminantes, vazamento da fase móvel, a própria pré-coluna serve como um protetor da coluna. ▪ A falta de cuidado pode ocasionar em alargamento do pico, pico com ombro e pico dividido;
Os compostos mais polares saem primeiro, ou seja, quanto menor o tempo de retenção mais polar é a

Reservatório do gás e controles de vazão/pressão: possui o gás de arraste que é a fase móvel;
Injetor: vaporizar a amostra; 2.1 septo 2.2alimentação de gás de arraste 2.3bloco metálico aquecido 2.4ponta da col. cromat.
Coluna Cromatográfica e forno da coluna: a. Tipos de coluna:
- Coluna empacotada:
- Coluna capilar: b. Temperatura da coluna:
- Regulada pelo forno;
- Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna depende da temperatura: Temperatura da coluna Pressão de vapor Velocidade de degradação Analito elui mais rapidamente (menor retenção)
- Temperatura muito elevada acontece sobreposição de picos como mostrado no ultimo gráfico, a ideal é a do meio;
  - Programação da temperatura no forno: pode variar linearmente durante a separação:
Detector:

Existem 60, 15 comerciais e 4 principais que são: DCT TCD: Detector por Condutividade Térmica, mede a diferença entre a condutividade térmica entro o gás de arraste e o gás de arraste + amostra; DCE ECD: Detector por captura de elétrons; detector seletivo para captar informação em compostos com halogênios; DIC FID: Detector por Ionização em Chama, ionização através da queima que gera partículas ionizáveis EM MS: Detector por espectro de massas, fornece informação sobre os fragmentos (íons) da molécula e sua massa molecular;

Eletrônica de tratamento (amplificação) de sinal
Registro de sinal (registrador ou computador). Observação: em vermelho temperatura controlada

o Fase móvel: ▪ Comumente chamado de gás de arraste; ▪ Não interage com a amostra; ▪ Requisitos:

Inerte não deve reagir com a amostra, fase estacionária ou superfícies do instrumento;
Puro deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária;
Gases mais utilizados:
- He - N 2 - H 2 - Ar o Fase estacionária: ▪ Características ideais:
Ampla faixa de temperatura de uso;
Boa estabilidade química e térmica;
Pouco viscosa;
Alto grau de pureza; ▪ Fase estacionária líquida:
Maior parte das aplicações em CG;
Poliglicóis: polietilenoglicol;
Parafinas;
Poliésteres;
Silicones: polisiloxanas (a mais empregada em CG)

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