EXAMES PARASITOLOGICOS, Manuais, Projetos, Pesquisas de Parasitologia

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FACULDADE DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS DE CACOAL - FACIMED

CURSO DE GRADUAÇÃO EM BACHAREL EM FARMÁCIA

EXAME PARASITOLOGICO DE SANGUE

EXAME PARASITOLOGICO DE FEZES

Cacoal/RO 2020

EXAME PARASITOLÓGICO DE SANGUE

INTRODUÇÃO

O exame microscópico do sangue constitui valioso recurso para o diagnóstico das doenças parasitárias cujos agentes apresentam formas evolutivas sanguíneas. A preparação de bons esfregaços sanguíneos é importante na diferenciação de parasitos, principalmente de protozoários. Do ponto de vista da parasitologia, existem algumas técnicas largamente utilizadas no exame do sangue e de tecidos com o intuito de detectar a presença de parasitas. Estas técnicas descritas na literatura apresentam valores de sensibilidade e especificidade variáveis no que tange à detecção de formas parasitárias em diferentes tecidos, podendo ser a detecção realizada de maneira direta ou indireta.

1. MÉTODO PARASITOLÓGICO DIRETO 1.1. Fundamentos Conforme relatado anteriormente, os métodos parasitológicos diretos baseiam-se na pesquisa direta do parasita na amostra clínica. Eles podem ser realizados em laboratórios clínicos com condições mínimas de equipamentos, porém é necessário que o profissional tenha passado por um treinamento de reconhecimento do parasito. É importante ressaltar que os métodos parasitológicos diretos só apresentam alta sensibilidade na presença de parasitemia patente, sendo por isso o método de escolha na suspeita de casos agudos ou de reativação da infecção. 1.2. Coleta da amostra O sangue pode ser colhido por punção do lóbulo da orelha, da superfície palmar da ponta de um dedo da mão, no caso de lactentes da superfície plantar do grande artelho ou no calcanhar. No caso da orelha, é a margem livre do lóbulo e não a face lateral que deve ser puncionada. A picada deve ser feita com deliberação e lentamente, para não provocar dor. A picada deve ter profundidade de 3mm. Não se deve utilizar um local edemaciado ou congestionado. Em animais de laboratório a colheita de sangue é feita segundo o seu porte.

não ser submetida à desemoglobinização. As distensões finas conservam por maior tempo a coloração original e resistem mais ao atrito após a remoção do óleo de imersão. 2.2.1. Confecção e coloração das distensões 1ª ETAPA: COLETA DA AMOSTRA E PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS

1. Colocar uma pequena gota de sangue, coletada por punção digital ou venosa, na extremidade da lâmina. Tocar a gota de sangue com a borda estreita da lâmina sem canto (lâmina extensora), formando um ângulo de 45º com a face superior da lâmina;
2. Fazer com a lâmina extensora um ligeiro movimento para trás, até encostar na gota de sangue. Deixar que a gota se difunda uniformemente, ao longo da borda da lâmina extensora, por capilaridade;
3. Levar a lâmina para frente, de forma que ela carregue a gota de sangue que se quer estender numa camada delgada e uniforme. É essencial escorregar a lâmina extensora de uma só vez, sem deter-se. O movimento de extensão deve ser uniforme;
4. Deixar secar à temperatura ambiente ou em uma estufa a 28 º C. 2ª ETAPA: COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GIEMSA Neste tipo de coloração descrito, utilizamos o corante Giemsa. A solução de Giemsa destina-se a coloração de esfregaços do sangue ou da medula óssea in vitro, consistindo numa solução tampão de tiazina e eosinato concebida para a coloração de elementos figurados do sangue. Esse corante poderá ser utilizado em separado ou em conjunto com o corante May- Grünwald. O Giemsa, que cora especificamente os grupos de fosfato do ADN, liga-se a regiões onde há alta quantidade de ligações A-T (Adenina - Timina). Em uma coloração bem feita, os núcleos celulares apresentarão diversos tons de púrpura. A coloração citoplasmática apresentará diversos tons de azul a cor-de-rosa claro. As etapas estão descritas a seguir:
5. Fixar as lâminas com álcool metílico livre de acetona durante 1 a 2 minutos à temperatura ambiente (1 min é o suficiente);
6. Corar as distensões com solução de Giemsa, preparada no momento da coloração na concentração de 1 volume de Giemsa para 9 volumes de água tamponada (pH 6,8);
7. Colocar o corante sobre a lâmina ou imergir em frasco de vidro tipo Coplin, deixando por cerca de 5 a 10 minutos;
8. Lavar a lâmina em água da torneira (fluxo fino);

5. Escorrer a água e deixar secar. 2.3. Gota espessa É um método simples e eficaz de diagnóstico, além de ter baixo custo. A gota espessa é também o método oficialmente utilizado no Brasil, para o diagnóstico da malária. Sua técnica baseia-se na visualização do parasito, através de microscopia ótica, após coloração pelo método de Walker ou Giemsa. Permite a diferenciação específica dos parasitos a partir da análise de sua coloração, da morfologia e de seus estádios de desenvolvimento no sangue periférico, devido a sua alta concentração. Para a confecção da gota espessa, podemos colocar pequenas gotas de sangue nas posições relativas aos vértices de um quadrado imaginário e uni-las com um movimento circular utilizando um palito descartável ou o vértice de uma lâmina comum. 1ª ETAPA: PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS
6. Coletar o sangue por punção digital ou venosa;
7. Aplicar 4 gotas na parte central da lâmina, de maneira que fiquem próximas umas das outras. Tais gotas são reunidas para formar “uma mancha” circular de um centímetro de diâmetro ou quadrada; usa-se para isso a ponta de outra lâmina;
8. Conservar a lâmina assim preparada em lugar abrigado, até que fique seca. Isto se obtém no mínimo após 1 hora;
9. Uma vez seca a camada espessa de sangue, desemoglobinizála colocando a lâmina em posição vertical e mergulhada em um frasco contendo água destilada morna;
10. A desemoglobinização verifica-se, geralmente, após 10 minutos. Ao retirar a lâmina da água, nota-se que o sangue perdeu sua cor, tornando-se esbranquiçado. 2ª ETAPA: COLORAÇÃO PELO GIEMSA
11. Após a desemoglobinização, sem fixar a preparação, empregar o método comum de coloração pelo Giemsa;
12. Em 2 ml de água destilada acrescentar 3 gotas de Giemsa (vide solução mãe no item Preparação de Soluções) e agitar bem. Cobrir a lâmina, já desemoglobinizada, com o Giemsa diluído e deixar cerca de 15 minutos;
13. Passados os 15 minutos, lavar a lâmina em água destilada e deixar secar.

EXAME PARASITOLÓGICO DE FEZES

4. MÉTODO DE SEDIMENTAÇÃO ESPONTÂNEA (HOFFMAN, PONS & JANER)

4.1. Fundamento Precipitação de partículas, inclusive de cistos, ovos e larvas de parasitos ao fundo do cálice de sedimentação, devido a força de gravidade. 4.2. Indicação Utilizado na pesquisa de ovos de S. mansoni, é atualmente usado na rotina diária dos laboratórios, na detecção de cistos de protozoários, de ovos e larvas de helmintos. Adolf Lutz, eminente pesquisador brasileiro, empregou o modelo pela primeira vez, no entanto, foi a partir dos trabalhos de Hoffman, Pons e Janer, que a técnica passou a ser conhecida mundialmente. A vantagem deste método é a economia dispensando o uso de reagentes e centrífugas. A desvantagem é a grande quantidade de detritos fecais, dificultando, com frequência a preparação e o exame da lâmina. 4.3. Procedimento

1. Colocar cerca de 5g de fezes, coletados de várias partes do bolo fecal, em copo graduado ou Becker de 250 ml. Completar o volume de 50 a 60 ml de água corrente e misturar vigorosamente.
2. Preparar a suspensão juntando 100 ml de água corrente.
3. Filtrar essa suspensão através de gaze dobrado 4 vezes, recolhendo-a em copo de sedimentação de capacidade de 125 ml.
4. Se necessário, adicionar água corrente, até completar aproximadamente ¾ do volume do copo cônico. Deixar a suspensão em repouso durante 1 a 2 horas.
5. Com uma longa pipeta capilar, fixada a um bulbo de borracha, colher uma pequena porção do sedimento na camada inferior, depositando sobre uma lâmina. Se a preparação estiver muito espessa, diluir com uma gota de solução salina a 0,85% ou água corrente. Colher amostra adicional do centro e do fundo do sedimento.
6. Examinar ao microscópio, a presença de ovos, larvas e cistos.

5. CENTRÍFUGO-FLUTUAÇÃO PELO SULFATO DE ZINCO (FAUST & Cols.) 5.1. Fundamento Flutuação de cistos de protozoários e ovos leves de helmintos em solução de sulfato de zinco. 5.2. Indicação Indicado na pesquisa de protozoários e de ovos leves de helmintos ( Ancilostomídeos, Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura ). Esta técnica é imprópria para espécimes que contenham grande quantidade de gorduras. A técnica pode ser utilizada com fezes preservadas em formaldeído, SAF e outros fixadores, no entanto a densidade específica deverá se ajustada em 1.2 g/mL. O aumento de densidade poderá resultar em uma distorção dos organismos. 5.3. Procedimento 1. Colocar 1 ou 2 g de fezes coletadas de várias partes do bolo fecal em frasco contendo 10 ml de água. Filtrar a suspensão através de gazes dobradas em quatro vezes, e receber o filtrado em um tubo cônico de centrífuga de 15 ml. 2. Adicionar água corrente até completar 2/3 da capacidade do tubo. Centrifugar (650x g (2500rpm) por 1 minuto). 3. Decantar o sobrenadante e adicionar 1 a 2 ml de água corrente ao sedimento, antes de ressuspendê-lo. Completar com água 2/3 do volume do tubo, agitar e centrifugar. 4. Repetir a etapa 3, até que o sobrenadante apresente-se relativamente claro. 5. Depois que o último sobrenadante é decantado, adicionar 1 a 2 ml do reagente, e ressuspender o sedimento: completar com sulfato de zinco 33% até 0,5 cm da borda do tubo e centrifugar (650x g(2500rpm) por 1 min). 6. Cuidadosamente, remover o tubo da centrifuga e, sem agitação. Coloca-lo em uma estante em posição vertical. 7. Com uma alça de arame (diâmetro de 5 a 7 mm) tocar no centro da membrana formada na superfície, transferido várias alçadas para uma lâmina de microscopia. Examinar ovos larvas e cistos. 8. Depois de concluída a etapa 4, com auxílio de pipeta, encher o tubo até a borda com solução de sulfato de zinco. Colocar uma lamínula (22 x 22 mm) na superfície do tubo. Deixando-a em contato com o líquido durante 8 a 10 minutos. Remover a lamínula, invertendo a sua posição, e colocar a face com a gota sobre uma lâmina. Examinar para larvas e cistos.

7.2. Indicação Indicado na pesquisa de larvas de Strongyloides stercoralis. Demonstra também a presença de larvas de ancilostomídeos e por vezes até adultos de nematódeos pequenos como E. vermiculares. Ao serem examinadas fezes que permaneceram, antes do exame, em temperatura ambiente por período superior a 24 horas, ou ainda de indivíduos que sofrem de constipação intestinal, ocorre a possibilidade de que as larvas encontradas sejam rabditóides ou filarióides de ancilostomídeos e não de Strongyloides stercoralis 7.3. Procedimento

1. Encher o funil com água corrente, aquecida a 40-45ºC.
2. Abrir a pinça de Mohr, deixando escorrer uma pequena quantidade de água para evitar a formação de bolhas de ar na haste e no tubo de látex.
3. Colocar 8 a 10 g de fezes, recentemente emitidas, sobre gaze dobrada quatro vezes e, se necessário, juntar mais água, até que as fezes fiquem submersas.
4. Deixar em repouso durante 60 minutos.
5. Abrir a pinça e coletar parte do líquido em vidro de relógio; examinar ao microscópio estereoscópio (aumentos 20 a 30x). Deixar em repouso durante alguns minutos, pois desta forma as larvas migrarão para o centro do vidro de relógio, ou proceder de acordo com o item 6.
6. Coletar em tubo cônico de centrífuga. Centrifugar (500x g por 1 min), e examinar o sedimento entre lâmina e lamínula. Corar a preparação com solução de Lugol, para a identificação das características morfológicas das larvas, e examinar ao microscópio com aumento de 20x. 8. MÉTODO DA FITA GOMADA 8.1. Fundamento Baseia-se na utilização da fita gomada na apreensão de estágios evolutivos de parasitos, localizados na região perianal.

8.2. Indicação Este método é indicado para a pesquisa de todos os parasitos que prioritária ou ocasionalmente se deslocam até a região perianal. Assim sendo, poderemos detectar o Enterobius vermicularis , Taenia sp , e eventualmente ovos de Ascaris lumbricoides , Ancilostomídeos e Trichuris trichiura. 8.3. Procedimento

1. Coleta do material deverá ser realizada pela manhã antes que o paciente realize sua higiene. Recomendar que o paciente não utilize pomada ou outro qualquer medicamento de uso tópico na região anal ou perianal na noite anterior ao exame.
2. Tomar um pedaço de fita gomada com aproximadamente 10 cm, colar nas extremidades dois retângulos de papel "oficio", a fim de servirem para identificação dos pacientes e manuseio do técnico, sem risco de contaminação.
3. Montar em tubo de ensaio (l5xI50) de modo que a parte adesiva permaneça livre, na parte externa do fundo do tubo.
4. Recomendar que o paciente fique em decúbito ventral, e aplicar a fita gomada montada sobre a região perianal, tendo o cuidado de afastar os glúteos.
5. Após a coleta, aplicar a fita gomada sobre a lâmina pressionando levemente do centro para a periferia a fim de evitar a apreensão de bolhas de ar.
6. Preparar no mínimo duas lâminas. Em seguida levar a microscopia.
7. As lâminas assim preparadas poderão ser encaminhadas até dois meses após, devido a capacidade de conservação da técnica.