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GENERALIDADES SOBRE BIOTECNOLOGIA
Prof. Titular Michele Vitolo Depto. Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP.
1. Biotecnologia: Conceito e Visão Geral 1.1. Definição A biotecnologia é o conjunto de técnicas que permitem gerar produtos de interesse econômico e/ou social a partir de organismos vivos e/ou de seus componentes. 1.2. Breve histórico A biotecnologia, tão decantada nos últimos vinte anos, vem sendo usada pelo homem há milênios através da fabricação de cerveja (produzida pelos Sumérios e Babilônios desde 6000 AC), pão (produzido pelos egípcios desde 4000 AC), vinho e queijo – há registro sobre a fabricação destes produtos desde 3000 AC – , dentre outros. Sucede que estes produtos biotecnológicos eram produzidos por meio de técnicas artesanais desenvolvidas de modo completamente empírico, desconhecendo-se os mecanismos envolvidos nos processos de fabricação. Porém, no século XVII foi inventado o microscópio óptico por Antonie van Leeuwenhoek, com o qual foi possível reconhecer formas de vida invisíveis ao olho humano. Os conhecimentos acumulados sobre os microrganismos levaram Pasteur (1857-1876) à conclusão de que eles eram os agentes responsáveis pela ocorrência dos processos fermentativos. Uma vez elucidado o mecanismo da fermentação, foi possível desenvolver novos processos fermentativos para a fabricação de outros produtos de interesse comercial, tais como etanol, ácido acético, butanol e acetona. Todos estes processos eram executados em condições não assépticas. O tratamento anaeróbico do lixo urbano, amplamente usado na atualidade, pode ser enquadrado dentro deste contexto. A partir de 1940 foram desenvolvidos processos fermentativos realizados em condições assépticas, nos quais eram empregadas culturas de cepas microbianas puras. Em decorrência, foi possível produzir antibióticos, esteróides, amino ácidos, vacinas, enzimas, dentre inúmeros outros produtos. O grande avanço na tecnologia de fermentação deveu-se à obtenção de cepas microbianas puras altamente produtivas nos produtos específicos desejados. Isto foi conseguido através do melhoramento genético das cepas selvagens. A técnica amplamente empregada para este fim – a partir de 1940 - foi a seleção de mutantes com as características desejadas. As mutações eram provocadas com agentes físicos (por exemplo, luz UV) ou químicos, os quais causavam modificações aleatórias no DNA da célula, sendo os mutantes selecionados a partir de meios de cultura desprovidos de nutrientes específicos. O cruzamento seletivo entre cepas aparentadas, sobretudo da mesma espécie, também foi muito usado para o melhoramento celular. No entanto, a grande reviravolta – ocorrida em 1972 - no melhoramento da capacidade produtiva das células (microbianas ou não) foi o desenvolvimento das tecnologias do DNA- recombinante e da fusão de células (hibridoma) – as quais constituem a chamada engenharia genética - que possibilitaram a introdução de mudanças específicas e planejadas diretamente no DNA celular (Tabela 1).
TABELA 1. Cruzamento seletivo/mutação versus engenharia genética (1). Parâmetros Cruzamento seletivo/mutação Engenharia genética Nível Todo o organismo Célula ou molécula Precisão Conjunto de genes Um só gene Certeza Mudança genética fracamente caracterizada Gene bem caracterizado Taxonômico Possível apenas dentro ou entre espécies, raramente entre gêneros Sem limitação 1.3. O contexto biotecnológico O contexto biotecnológico pode ser visto como um conjunto de técnicas, que permitem modificação pontual e específica do DNA celular (procarióticos e eucarióticos, indistintamente), centrado nas enzimas, proteínas catalisadoras não só responsáveis pela existência da vida tal qual a conhecemos, mas também responsáveis pela existência das próprias técnicas biotecnológicas fundamentais (fusão celular e DNA recombinante) e dos processos biotecnológicos básicos (fermentação e cultura de células não microbianas). Na Figura 1, dá-se uma idéia pictórica da posição das enzimas dentro da biotecnologia. SÍNTESE DO ADN (Kornberg, 1967) FISIOLOGIA, GENÉTICA e BIOQUÍMICA CELULAR ADN-RECOMBINANTE (Bayer, 1927)
HIBRIDOMA
(MILSTEINE, 1975)
ENZIMAS
FERMENTAÇÃO CULTURA DE TECIDOS
NOVOS PRODUTOS E/OU NOVOS PROCESSOS
Figura 1. As enzimas e o contexto biotecnológico.
2. Biotecnologia, Alimentos e Enzimas Focando na tecnologia de alimentos, pode-se dizer que o sucesso desta área medido pela enorme variedade de produtos oferecidos nos supermercados - repousa no casamento perfeito dos aspectos formulação, processamento e embalagem. O tecnólogo seleciona as matérias-primas a ser misturadas, mistura-as nas quantidades preconizadas na formulação, submete-as a um pré-processamento (lavagem, maceração, cozimento, etc.), obtendo, em seguida, uma massa, à qual adiciona os coadjuvantes necessários (acidulante, corante, aromatizante, etc.). Após o processamento final (cozimento, extrusão, secagem, controle analítico, etc.) resulta o produto almejado, o qual é embalado e enviado ao mercado. A princípio, o setor agro-pecuário – fonte das matérias-primas alimentícias – recebeu muita atenção no sentido do aumento da produtividade agronômica em detrimento da melhoria das características da matéria-prima, visando simplificar o processamento industrial da matéria-prima. Por exemplo, seja o caso do tomateiro, que requer estacas para poder se desenvolver e produzir o tomate, o qual só pode ser colhido manualmente. Para aumentar a produtividade e diminuir o custo da plantação, desenvolveu-se uma variedade de tomateiro baixo, de tal sorte a prescindir do estaqueamento, propiciando colheita mecanizada. Somente nos últimos anos, esforços têm sido direcionados no sentido de obter-se um tomate com maior teor de sólidos solúveis (menos água), visando a economia de energia no processo de produção da massa de tomate para molho. De um modo geral, pode-se dizer que a biotecnologia vem contribuindo com o desenvolvimento da tecnologia de alimentos através de quatro vertentes, a saber, melhoramento das fontes de matérias-primas, produção de ingredientes específicos para a indústria alimentícia, satisfação de demandas específicas de mercado e melhoramento de processos. 2.1. Melhoramento das Fontes de Matérias-Primas Neste caso, tem-se o aumento da produtividade do cultivar (caso do tomateiro rasteiro) e a melhoria dos atributos funcionais da matéria-prima. Para este último caso, lembram-se, por exemplo, os híbridos do milho e do trigo, os quais, respectivamente, possuem menos lipoxigenase (a operação unitária de branqueamento é abolida) e melhor distribuição da amilose no grânulo de amido (diminuição do “amanhecimento” do produto final). 2.2. Produção de Ingredientes Específicos para a Indústria Alimentícia Na fabricação de alimentos são necessários inúmeros ingredientes, que devem estar sempre disponíveis no mercado e em grandes quantidades, geralmente. Por exemplo, aminoácidos (ácido glutâmico, ácido aspártico, fenilalanina, lisina, metionina), vitaminas (complexo B, tocoferol), enzimas (proteases, carboidrases, pectinases, etc.), dentre outros. Para esta situação, a biotecnologia colabora possibilitando o aperfeiçoamento genético de microrganismos – sobretudo através da técnica do DNA recombinante – que produzem os compostos citados nas quantidades exigidas pelo mercado. Em outros termos, o processo fermentativo é otimizado.
2.3. Satisfação de Demandas Específicas de Mercado Atualmente os consumidores exigem que os ingredientes dos alimentos sejam os mais naturais possíveis e o valor calórico não seja exagerado. A indústria alimentícia respondeu a estas demandas incluindo nas formulações ingredientes naturais (extrato de vanila, destilado de cacau, mentol, jasmim, shikonina, manteiga de cacau, conchinilha do Peru, por exemplo) e reduzindo o teor de açúcares (cerveja de baixa caloria produzida adicionando-se na dorna de fermentação a glicoamilase, que hidrolisa os oligossacarídeos residuais em glicose, a qual é totalmente metabolizada pela levedura. Em outros alimentos, pelo acréscimo de adoçantes não açucarados como taumatina, esteviosídeos, aspartame). Sucede que muitos ingredientes naturais são caros (por ex., os preços do quilo do extrato de vanila, mentol, jasmim e shikonina são US$ 100, US$ 30, US$ 4,600 e US$ 4,000, respectivamente), podendo a versão sintética existir (por ex., extrato de vanila e mentol aos preços de US$ 10/Kg cada um) ou não (por ex., jasmim, shikonina, conchinilha do Peru, etc.). A biotecnologia, portanto, deve criar meios que possibilitem a obtenção de ingredientes naturais em quantidade e a preços módicos, assim como produtos com baixo valor calórico. No caso da cerveja com baixa caloria, estão sendo desenvolvidas leveduras geneticamente modificadas (através da técnica do DNA recombinante), capazes de produzir glicoamilase (uma enzima fúngica), que durante a fermentação possibilita a conversão total da glicose em etanol. Nesta condição, evita-se a adição de glicoamilase exógena, reduzindo sobremaneira o perigo de contaminação da dorna, além de baratear o processo. No caso dos ingredientes naturais, merece lembrança a obtenção da shikonina a partir da planta shikon encontrada na China. A variedade natural do shikon produz a cada sete anos 0,02g de shikonina/planta, o que explicava o alto custo deste corante. Através da técnica biotecnológica da fusão celular, resultou uma variedade de shikon que produz a cada 23 dias a mesma quantidade de corante por planta. O preço da shikonina caiu vertiginosamente, tornando-se um dos corantes vermelhos mais utilizados na formulação de alimentos. O mercado atual de shikonina é da ordem de US$ 1 milhão/ano. 2.4. Melhoramento de Processos Os processos da indústria de alimentos podem ser melhorados tanto pelo aperfeiçoamento dos equipamentos (assunto não abordado) quanto pelo uso de enzimas. 2.4.1. Enzimas Na atualidade as enzimas são catalisadores muito utilizados na indústria (alimentícia, farmacêutica, têxtil, papel e celulose, químico-farmacêutica), em métodos analíticos (químicos e de diagnóstico), em medicamentos (por exemplo, auxiliares digestivos) e como alvos naturais de fármacos inibidores específicos (por exemplo, o omeprazol, fármaco usado para diminuir a quantidade de suco gástrico na luz do estômago, é um inibidor da enzima que catalisa a saída do ácido clorídrico das células acinares). Na Figura 3 apresenta-se a multiplicidade de usos das enzimas. 2.4.1.1. Fontes de enzimas
Para o produtor da enzima microbiana, o controle da quantidade produzida é uma questão fundamental, pois regular a fermentação no intuito de aumentar ou diminuir a quantidade de enzima obtida não é muito problemático. O que dificulta esta operação é a fase de purificação (“downstream”), porque é comum obter-se várias enzimas a partir de um mesmo processo fermentativo. Como resultado final pode ocorrer um desiquilíbrio nas quantidades das enzimas obtidas. Um procedimento geral usado pelo fabricante é o de obter suas enzimas com grau alimentício, mesmo que sejam usadas em outro setor. 2.4.1.2. Composição do Preparado Enzimático Comercial Antes de mais nada é preciso dizer que a composição exata do preparado enzimático comercial é segredo do fabricante. Contudo, uma formulação base constituir-se-ia de proteína e aminoácidos (10-15%), enzima (1-5%), carboidratos (5- 12%), açúcares/açúcares álcoois (2-40%), sais inorgânicos (3-40%) e conservante (0- 0,3%). Em linhas gerais, pode-se dizer que a composição do preparado enzimático depende: da forma de apresentação (pó ou solução), das unidades de atividade do
ENZIMAS
USO ANALÍTICO
DISPOSITIVOS
ANALÍTICOS REAGENTES
Diagnóstico/análises químicas REAÇÕES INTRACELULARES TERAPÊUTICA MEDICAMENTOS FÁRMACOS INIBIDORES DE ENZIMAS
PROCESSOS INDUSTRIAIS
INDÚSTRIA DE ALIMENTOS INDÚSTRIA QUÍMICO- FARMACÊUTICA OUTROS TRATAMENTO DE EFLUENTES TEXTIL PAPEL E CELULOSE Figura 3. Enzimas: as proteínas catalisadoras.
preparado, da fonte (as enzimas de origem animal e vegetal são bem menos definidas do que as de origem microbiana), da finalidade do preparado (aqueles para fins de diagnóstico e analítico devem possuir alto grau de pureza), do tipo de substância inerte adicionada para estabilizar/padronizar o preparado, e do tipo de conservante adicionado (este deverá levar em conta o tipo de processo no qual a enzima será usada, bem como as legislações dos países produtor e comprador). Em um processo industrial a quantidade de preparado enzimático utilizada representa algo entre 0,1 a 2% da massa total de substrato a ser transformada. 2.4.1.3. Condições de Armazenamento dos Preparados Enzimáticos As condições de armazenamento irão depender das características particulares dos preparados enzimáticos, sobretudo a forma de apresentação. Preparados em pó e secos a 25ºC duram 6 meses, mas entre 4-10ºC duram mais de 12 meses. Porém, os preparados líquidos a 25ºC duram 6 meses e entre 4-10ºC em torno de 9 meses. 2.4.1.4. Fatores para a Escolha de um Preparado Enzimático Industrial Condições operacionais de processo a considerar por ocasião da escolha da enzima a ser empregada: a) Tipo do substrato: influi no grau de especificidade da enzima a ser selecionada em função do produto final desejado. Por ex., seja a modificação enzimática da proteína da soja. Caso o objetivo seja o de obter o chamado leite de soja – hidrólise total da proteína – emprega-se uma protease inespecífica e de alta atividade. Mas, se o objetivo é obter uma proteína de soja funcionalizada (ou seja, proteína com baixo grau de hidrólise para ser usada como, digamos, emulsificante) então a protease a ser usada deve ter um alto grau de especificidade; b) pH : o ideal seria usar um pH adequado tanto para a reação enzimática quanto para a primeira operação unitária do protocolo de “downstream”. Há casos, no entanto, em que o pH do processo não pode ser alterado, daí a enzima a ser selecionada deverá possuir boa atividade catalítica à concentração hidrogeniônica pré-estabelecida. Lembra-se que o desempenho catalítico da enzima poderá ou não ser significativamente afetado pelo pH do meio reacional. Testes de estabilidade devem ser efetuados previamente; c) Temperatura: a temperatura de processo deverá ser ajustada de tal sorte a equilibrar a ativação e a inativação térmica da enzima. Quanto mais alta a temperatura, as velocidades de ativação e de inativação serão mais elevadas. Para favorecer a catálise basta trabalhar por um tempo suficiente para a conversão desejada do substrato. Caso se deseje empregar enzima termoestável, deve-se levar em conta que ela poderá continuar ativa no produto final, e que, conforme o caso, poderá ou não ser desejável; d) Ativadores e Inibidores : a necessidade destas substâncias para executar a reação depende do tipo de enzima escolhida. Há casos em que a presença ou ausência deles afeta a performance catalítica da enzima, podendo, inclusive, interferir em parâmetros como pH e temperatura. Por exemplo, no caso da glicoseisomerase – enzima usada na fabricação de xaropes de frutose, muito usados como adoçantes em formulações alimentícias e farmacêuticas – o íon magnésio atua como ativador, ao passo que o íon cálcio age como inativador. Em geral, bloqueadores da atividade enzimática devem ser evitados, sobretudo na área de alimentos. Além dos fatores mencionados, estritamente ligados ao processo em si, devem ser lembrados, também, os métodos de análise – devem ser simples e de fácil execução. São importantes para controlar a atividade do preparado enzimático
A posição destacada das enzimas na área de alimentos deve-se à: a) atoxicidade e serem substâncias naturais; b) especificidade em relação ao substrato e à estereoespecificidade de ação; c) atuação em condições brandas de temperatura e pH; d) eficiência catalítica a baixa concentração; e) fácil inativação. 2.4.1.6. Limitações na Variedade de Enzimas Comercializadas É notório o descompasso entre o número de enzimas atualmente conhecidas, sendo muitas já bem caracterizadas tanto em termos estruturais quanto cinéticos, e a quantidade de enzimas realmente usadas em processos industriais. A razões prováveis para explicar este fato seriam: a) dificuldade de se obter a maioria das enzimas conhecidas em quantidades industriais e a custo compatível com o do produto final; b) atuação inadequada de muitas enzimas nas condições reais de processo; c) origem intracelular da maioria das enzimas conhecidas, as quais normalmente são de custo elevado; d) exigência de cofatores caros pela maioria das enzimas conhecidas (oxidorredutases, liases, etc.). A solução de boa parte dos problemas mencionados serão, provavelmente, oferecidos pela biotecnologia. Por exemplo, o barateamento das enzimas poderia advir do emprego de microrganismos geneticamente modificados que as excretariam para o meio de cultivo (produção de quimosina por Eschericchia coli e/ou Saccharomyces cerevisiae portadores em seus genomas do gene codificador desta enzima transferido a partir de bezerros), e/ou através da reutilização do catalisador imobilizado em material inerte (produção de xaropes de frutose usando a glicoseisomerase imobilizada). Salienta-se que o processo enzimático em si poderia, também, ser melhorado através do uso de biorreatores mais adequados, como por exemplo o reator com membrana (reator continuamente agitado acoplado a membrana de ultrafiltração através do qual consegue- se associar a reação catalisada e a separação do produto simultaneamente). 2.4.1.7. Fatores que Impelem a Produção de Enzimas Industriais Atualmente o fabricante de enzimas deve suprir o mercado com catalisadores de alta qualidade para usos em processos cada vez mais específicos a preços módicos. Daí resulta que o desenvolvimento de enzimas aplicáveis em processos industriais é estimulado por vários fatores, a saber, potencialidade do mercado, custo de processamento, qualidade requerida e disponibilidade tecnológica. Apesar da limitações apontadas no item 2.4.1.6 – que fazem com que 10% do total de três mil enzimas conhecidas, sejam efetivamente usadas - , as enzimas passaram a estar disponíveis no mercado em meados do século XX, podendo a disponibilidade delas ao longo das décadas ser elencada como segue: (1900-1910): -amilase; (1911- 1920): invertase; (1921-1930): nenhuma enzima nova surgiu no mercado; (1931- 1940): proteases; (1941-1950): celulases e pectinases; (1951-1960): catalase, glicose oxidase; (1961.......): lípases, lactases, coalhos, aminoacilase imobilizada, uroquinase, asparaginase, estreptoquinase, glicoseisomerase imobilizada,......... Finalmente, a importância econômica das enzimas pode ser intuída a partir das cifras crescentes envolvidas na sua comercialização. Assim, o mercado mundial de enzimas nos anos de 1983, 1995 e 2007 movimentou montantes da ordem de US$ 400 milhões, US$ 1 bilhão e US$ 2 bilhões, respectivamente.
3. Biotecnologia: Interesse Empresarial e P&D 3.1. Características Gerais das Empresas Biotecnológicas As empresas biotecnológicas em linhas gerais apresentam várias características notórias, a saber, mão de obra não intensiva, diversificada e intelectualizada, manipulação de materiais renováveis e recicláveis, empresas de porte pequeno ou médio, uso de processos que requerem pouca energia, gerenciamento específico (deve considerar obrigatoriamente: as leis particulares que regem o setor, a reação do consumidor, (bio)segurança [riscos à saúde e ao meio ambiente]), risco financeiro alto, produtos de vida média de mercado curta, P&D continuado e capital inicial elevado com perspectivas de retorno a médio ou longo prazo. 3.2. Exemplos de Setores Altamente Impactados pela Biotecnologia Dentre os inúmeros setores de atividade industrial, aqueles que mais impacto vêm sofrendo com o advento e desenvolvimento da biotecnologia são: a produção de alimentos, a substituição de derivados de petróleo, geração de fontes de energia alternativa, reciclagem do lixo, controle da poluição, silvicultura, síntese de fármacos e setores médico e veterinário. A título de exemplo, comparam-se o comportamento dos setores químico- farmacêutico e o de alimentos frente às inovações da biotecnologia. O setor de alimentos enxerga a biotecnologia como oportunidade para reduzir custos – aliás como já enfatizado – , melhorar processos, não se ater às questões de patenteamento e investir no máximo 1% do lucro no desenvolvimento de bioprodutos. Neste último caso, preferem investir em empresas biotecnológicas emergentes e, somente quando um bioproduto apresentar viabilidade econômica segura, elas se envolvem efetivamente na sua produção, venda e/ou utilização. A indústria químico-farmacêutica, por sua vez, se compromete mais intensamente com os avanços da biotecnologia, despendendo em P&D, no mínimo, 10% das vendas. O desenvolvimento de tecnologia, a ênfase extremada nas propriedades e qualidades do bioproduto a ser produzido e o grande interesse na valorização e respeito ao patenteamento dos bioprodutos constituem-se, também, em objetivos prioritários para este setor. 3.3. Fatores que Afetam as Aplicações da Biotecnologia Caso fosse possível fazer um levantamento global completo dos produtos e processos possíveis de serem comercializados, provavelmente concluir-se-ia que nas gavetas dos grandes laboratórios e empresas de biotecnologia existem muito mais produtos do que aqueles realmente lançados no mercado. As razões para este freio na biotecnologia comercial proviria de uma série de fatores, a saber: o elevado montante de investimento para desenvolver o bioproduto por parte do setor produtivo, a existência de uma lei de patentes adequada e a seriedade em seu cumprimento (sobretudo em países emergentes), elaboração de estratégias específicas de marketing e comercialização (estritamente dependentes do tipo de bioproduto a ser comercializado), aceitação dos bioprodutos pelos consumidores e, finalmente, o custo de produção do bioproduto deve ser competitivo frente ao custo de um produto análogo obtido por via não biotecnológica.
(6) WOLFBERG, A. Genes on the web – direct-to-consumer marketing of genetics testing. New England Journal of Medicine, v. 355 , n.6, p.543-545, 2006. (7) CASTLE, D. Science, society and the supermarket: the opportunities and challenges of nutrigenomics. Wiley Interscience, 2007. (8) BON, E.P.S., FERRARA, M.A., CORVO, M.L. Enzimas em Biotecnologia. Rio de Janeiro, Editora Interciência LTDA, 2008. (9) TARABOULSI-Jr, F.A. Enzimas microbianas na conversão da sacarose em frutose e ácido glicônico usando reatores descontínuo-alimentado e contínuo com membrana. Dissertação de Mestrado, 98p., 2010. Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP [Programa de Pós-Graduação em Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica].
