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Genomas extranucleares: conceitos e aplicações
¹ - Universidade Federal da Grande Dourados – Faculdade de Ciências Biológicas e Ambientais.
Resumo: O principal material genético presente na célula é encontrado no núcleo, mas estruturas presentes no citoplasma celular também possuem genoma, são elas mitocôndrias e cloroplastos. Acredita-se que essas organelas foram derivados de bactérias endosimbióticas. O papel da biologia molecular é identificar qual o papel dessas estruturas e utilizar isso em prol de benefícios à ciência. No presente trabalho elucidou-se algumas aplicações para estudo desse genoma extracelular através do uso da biologia molecular.
Palavras-chave: Cloroplasto, Mitocôndria, DNA, Biologia Molecular.
Introdução:
1.1 – Herança extranuclear A herança extranuclear é a transmissão dos genes que ocorrem fora do núcleo. É encontrado na maiora dos eucariotos e ocorre em organelas citoplasmáticas, tais como a mitocôndria e os cloroplastos.
As mitocôndrias são organelas cuja função se resume a transformação de energia como resultado da respiração celular. Já os cloroplastos são organelas com função de produzir açúcares por meio da fotossíntese em plantas e algas. Os genes localizados na mitocôndria e cloroplastos são de enorme importância na manutenção funcional das células, mas seus genomas se replicam independentemente do DNA localizado no núcleo.
Existem três tipos de herança extranuclear:
Segregação vegetativa: resultado de replicação aleatória e partição de organelas citoplasmáticas. Ocorre com cloroplastos e mitocôndrias durante a mitose da célula e resulta em células-filhas com amostras aleatórias das organelas da célula parental. Um exemplo de segregação vegetativa é com a mitocôndria de células de leveduras replicadas assexuadamente. (BIRKY, et al., 1978)
Herança uniparental: ocorre em genes extranucleares e quando somente um dos pais passa DNA organelar para a prole. Um exemplo clássico de transmissão de gene uniparental é a herança materna da mitocôndria. A mitocôndria da mãe é transmitida para a prole na fertilização pelo ovócito. O gene mitocondrial do pai não é transmitido pelo espermatozóide. (SCHWARTZ et al.,2003).
Herança biparental: ocorre em genes extranuclares quando ambos os pais contribuem com DNA organelas para a prole. É mais incomum que a herança extranuclear uniparental, e costuma ocorrer apenas em casos à parte. Um exemplo de herança mitocondrial biparental é na levedura da Saccharomyces cerevisiae, quando duas células haplóides de sexos opostos se fundem e podem ambas contribuir com mitocôndrias para a prole diplóide. (BIRKY, 1994)
1.2 – Teorias do surgimento da mitocôndria e cloroplastos Várias teorias foram propostas para explicar o surgimento dessas organelas com material genético próprio. Uma delas postula que tanto mitocôndrias quanto cloroplastos tiveram origem em fragmentos de membrana e DNA da própria célula, ou seja, que essas organelas tiveram origem da própria célula eucariótica.
A teoria mais aceita atualmente é a que propõe que mitocôndrias e cloroplastos se originaram a partir de bactérias de vida livre que foram fagocitadas pelo ancestral dos eucariontes, um organismo heterotrófico anaeróbico primitivo.
1.2.1 - Teoria endossimbiótica Segundo essa teoria, mitocôndrias e cloroplastos são descendentes de bactérias que algum dia foram fagocitadas por células eucariontes heterotróficas, mas não foram digeridas; ou simplesmente invadiram eucariotos primitivos como parasitas, mas não tiveram sucesso em matar o hospedeiro. Tanto as mitocôndrias quanto os cloroplastos tiveram origem em uma predação mal sucedida, que ao invés de um dos organismos ser digerido pelo outro, ambos começaram a coexistir e com o tempo essa relação passou a ser obrigatória.
Os plastídios são organelas especiais das células vegetais. Os mais comuns e de maior importância biológica são os cloroplastos que, juntamente com as mitocôndrias, constituem as maquinarias bioquímicas que se encarregam de produzir as transformações energéticas necessárias para manter as funções das células. (DE ROBERTIS & HIB; 2001). Essa organela é capaz de desempenhar funções relacionadas ao metabolismo de nitrogênio, enxofre e fosforo, além de ser responsável pela biossíntese de ácidos graxos, aminoácidos, pigmentos e vitaminas. (MANSO; 2014). No caso dos cloroplastos, eles captam a energia eletromagnética derivada da luz solar e a convertem em energia química por um processo chamado fotossíntese. Depois utilizam essa energia juntamente com o C02 atmosférico para sintetizar vários tipos de moléculas, algumas das quais servem de alimentos para as mesmas plantas e para os organismos heterótrofos herbívoros. (DE ROBERTIS & HIB; 2001). Os cloroplastos localizam-se, principalmente, nas células do mesófilo, tecido que é encontrado nas folhas das plantas superiores e nas algas. Cada célula contém um número considerável de cloroplastos de forma esférica, ovóide ou discóide. Seu tamanho varia consideravelmente, porém, em média, têm um diâmetro de 4 a 6 μm. Esta medida pode ser constante para cada tipo celular, embora seja muito maior nas células poliplóides do que nas células diplóides. Em geral, nas plantas que crescem à sombra, os cloroplastos são maiores e mais ricos em clorofila. (DE ROBERTIS & HIB; 2001). O número de cloroplastos se mantém relativamente constante nos diversos vegetais. As algas possuem, às vezes, um único cloroplasto muito volumoso. Nas plantas superiores existem entre 20 e 40 por célula. Nas folhas de algumas espécies calculou-se que há cerca de 400.000 cloroplastos por mm2. Se seu número for insuficiente, aumenta por divisão; se for excessivo, reduz-se por degeneração. (DE ROBERTIS & HIB; 2001).
2.2 - Estrutura dos cloroplastos
O cloroplasto tem três componentes principais: o envoltório, o estroma e os tilacóides. O envoltório dos cloroplastos apresenta duas membranas - uma externa e outra interna - pelas quais ocorrem os intercâmbios moleculares com
o citosol. No cloroplasto maduro não se observa continuidade entre a membrana interna e os tilacóides. Ambas as membranas são desprovidas de clorofila, porém têm cor amarela pela presença de pigmentos carotenóides. Contêm unicamente 2% das proteínas do cloroplasto. (DE ROBERTIS & HIB; 2001). As duas membranas que envolvem os cloroplastos têm, cada uma delas, aproximadamente 6,0 nm de espessura e estrutura molecular típica de unidade de membrana. Entre elas fica o espaço intermembranoso. (JUNQUEIRA et al; 2000). A membrana externa contém porinas, proteínas que formam canais à semelhança dos existentes tanto na membrana mitocondrial externa como na membrana das bactérias. As porinas garantem que essa membrana seja livremente permeável a pequenas moléculas (com massa inferior a 13. dáltons). Ao contrário, a membrana interna do cloroplasto é impermeável a íons e metabólitos, os quais necessitam de transportadores específicos de membrana para serem translocados. (JUNQUEIRA et al; 2000). O estroma representa a maior parte do cloroplasto e nele se encontram imersos os tilacóides. É composto, principalmente, por proteínas. Contém DNA e também RNA que intervêm na síntese de algumas das proteínas estruturais e enzimáticas do cloroplasto. É no estroma que se produz a fixação do CO assim como a síntese de alguns ácidos graxos e proteínas. (DE ROBERTIS & HIB; 2001). Os tilacóides são sacos achatados agrupados como pilhas de moedas. Cada pilha de tilacóides recebe o nome de granum (plural grana), e a cada um dos elementos que formam as pilhas dá-se o nome de tilacóides dos grana ou intergrana. Além disso, há tilacóides que atravessam o estroma e que conectam dois grana entre si, denominados tilacóides do estroma. No entanto, a descrição anteriormente citada é enganosa, pois a rigor existem tilacóides pequenos - com um diâmetro médio de 1 μ,m (a maioria dos tilacóides dos grana) e tilacóides grandes e alongados, compartilhados por dois grana. Nestes, distinguem-se três setores: duas extremidades que aparentam ser tilacóides dos grana e um segmento intermediário que corresponde ao tilacóide do estroma. (DE ROBERTIS & HIB; 2001). A parede dos tilacóides - chamada membrana do tilacóide - é uma dupla camada lipídica repleta de proteínas e de outras moléculas, quase todas
organela. Esse genoma codifica ainda cerca de 20 proteínas ribossômicas e algumas subunidades da RNA polimerase, que são proteínas envolvidas na expressão gênica. (JUNQUEIRA et al; 2000). Também aproximadamente 30 proteínas que atuam na fotossíntese são codificadas pelos genes plastidiais, como componentes dos fotossistemas, dos citocromos e da ATP-sintase. O exemplo mais interessante é o da enzima RUBISCO, crítica para a fixação de carbono na fotossíntese, que tem a síntese de suas subunidades grandes codificada pelo genoma do cloroplasto e a das subunidades pequenas codificada pelo genoma nuclear. (JUNQUEIRA et al; 2000). Uma das enzimas que participa na elaboração de sacarídeos a partir do C02 - a ribulose 1,5-difosfato carboxilase - representa cerca de 50% das proteínas solúveis totais encontradas nos cloroplastos e, por isso, poderia ser a proteína mais abundante na natureza. Possui duas subunidades, uma de alto peso molecular (de cerca de 400 kDa) e outra menor (de cerca de 100kDa). (DE ROBERTIS & HIB; 2001). A subunidade maior é codificada por genes do DNA do cloroplasto, enquanto a menor é codificada por genes nucleares. Esta última é sintetizada no citosol (em ribossomos livres) sob a forma de uma molécula precursora, que ingressa no estroma do cloroplasto e ali é clivada, até alcançar seu tamanho definitivo. O envoltório do cloroplasto tem receptores que reconhecem os peptídeos sinalizadores das proteínas que devem ser incorporadas à organela. No caso da subunidade menor da ribulose 1,5-difosfato carboxilase, depois de entrar no cloroplasto, seu peptídeo sinalizador é excindido por uma protease presente no envoltório da organela e a subunidade é liberada no estroma. (DE ROBERTIS & HIB; 2001).
3.2 - Métodos de extração de DNA e seleção de primers de cpDNA
O DNA cloroplastidial é geralmente uma herança uniparental, em angiosperma é frequentemente maternal. Consequentemente a estrutura genética dos marcadores de cpDNA depende do fluxo de gênico via dispersão de sementes
(PETIT, 1993). Por isso, os estudos de filogeografia têm se baseado principalmente no polimorfismo do cpDNA, devido ausência de recombinação e a baixa taxa de mutação (NEWTON,1999).
Por isso, o estudo do cpDNA vem sendo utilizado para se estudar estratégias de conservação de espécies de plantas com crescimento crítico, como a Ficus bonijesulapensis, que possui distribuição geográfica descontínua, sendo restrita a afloramento de rocha carbonática (CASTRO; RAPINI, 2006).
Para criar essas estratégias é necessário realizar adequação da metodologia de extração de DNA (CSAIKL,1998), visando obter material de alta qualidade. Assim o objetivo do trabalho é selecionar o melhor método de extração e testar primers universais, visando a inferência filogeográfica de F. bonijesulapensis.
Para a amostragem foram selecionados 30 indivíduos em Bom Jesus da Lapa (BA) e São Desidério (BA). Amostras foliares foram coletadas e condicionadas em sacos contendo sílica gel, encaminhadas para o Laboratório de Conservação e Genética de Espécies Arbóreas da UFLA e armazenadas em freezer - 80°C.
Para comparar qual método de extração foi mais efetivo utilizou-se o protocolo de CTAB (DOYLE; DOYLE, 1990) e o protocolo de Moog e Bond (2003). Diversos primers foram testados: HA, SG, 20-12, BF, Q16, F32, TC, FV, VL, CS, DT, CS, Sfm, JA, TF, HK, K2Q.
Como resultado, o método Moog e Bond foi o mais eficiente, por ser mais rápido, econômico e por obter alta qualidade.
Os primers de melhor desempenho foram: HA, SG, BF, Q16, F32, FV, DT, CS E JA.
O modo conservativo de evolução do cpDNA sugere que qualquer mudança em estrutura, arranjo ou conteúdo do genoma pode ter implicações filogenéticas significativas. Atualmente, observa-se o crescimento de estudos filogeograficos em plantas que utilizam microssatélites de cpDNA (MAGRI, 2007; FAY, 2009).
quantificação do DNA extraído foi realizada por meio da análise comparativa com um padrão molecular. Nas análises genéticas foram utilizados cinco pares de iniciadores cpSSR universais desenvolvidos para angiospermas dicotiledôneas por Weising e Gardner (1999), a quantidade de haplótipos privados por população (np) e a proporção de alelos privados (np /nh) foram estimados. Após a amplificação, os fragmentos de DNA foram separados em gel desnaturante de poliacrilamida a 5% em tampão TBE 1X. O tempo de migração eletroforética foi de uma hora e trinta minutos em cuba vertical. Os produtos da reação de amplificação foram observados após coloração com nitrato de prata segundo metodologia de Creste et al. (2001). O comprimento dos alelos foi determinado por comparação com um marcador de peso molecular padrão DNA “ladder” de 10 pb. Os fragmentos amplificados de diferentes comprimentos foram considerados alelos diferentes.
Esse estudo permitiu detectar efeitos de gargalos genético e analisar essa população. Em Itapira observou-se um forte efeito fundador, sendo originado por uma única linhagem materna, já em Assis observou-se uma dispersão restrita de sementes.
4.1 - Genoma mitocondrial As mitocôndrias são organelas fundamentais no processo de obtenção de energia na célula, podendo se apresentar em tamanhos e formas diferentes, e a sua quantidade depende da demanda energética da célula. Em sua estrutura temos uma membrana externa lisa, pouco permeável, com enzimas relacionadas á síntese de lipídeos; membrana interna que forma invaginações denominadas cristas, alta permeabilidade e proteínas relacionadas á síntese de ATP. Entre as membranas, encontra-se a matriz mitocondrial, onde se tem todas as enzimas utilizadas no processo metabólico da mitocôndria.
O material genético, quando não está localizado nos cromossomos, é caracterizado como extranuclear. Nas mitocôndrias, é possível encontrar material genético diferente do material nuclear. Além de um tamanho reduzido, de aproximadamente 37 genes, tem formato circular e nele, não ocorrem recombinações, apenas mutações.
O conteúdo gênico foi descrito por Wostenholme, em 1992 e apresenta dois genes para a unidade ribossômica, que nesse caso é 12S e 16S, vinte e dois genes para RNA transportador, sete para subunidades de NADH desidrogenase, três para subunidades da enzima citocromo oxidase, dois para subunidades de ATPase e um para subunidades da enzima citocromo B. A região não codificadora é fica em adenina e timina, sendo encarregado de determinar a origem da replicação e transcrição.
4.2 - Hereditariedade Assim como qualquer material genético, também transmite informações de hereditariedade, algo que pôde ser comprovado com os estudos de Carl Correns, que analisou a coloração de Mirabilis jalapa, e v erificou que não houve interferência paterna, fato que desrespeita a segregação mendeliana, considerando que os dois parentais não contribuem de forma equivalente na transmissão de informações.
Buscando entender esse mecanismo, acreditava- se que para os mamíferos, as mitocôndrias do gameta masculino estavam localizadas na peça intermediaria e no momento da fecundação, pelo fato de que nem a cauda, nem a peça intermediária do gameta penetram no óvulo, consequentemente, havia a ausência da transmissão das mitocôndrias paternas.
Recentemente, em estudos com Caenorhabditis elegans, um verme nematóda, foi descoberto o possível motivo de não ser encontrado DNA mitocondrial paterno nas células. A mitocôndria produz uma enzima chamada CPS-6, que é liberada logo após a fecundação, fazendo com que a membrana mitocondrial perca sua integridade e todo material genético seja degradado, assim como a organela. Para entender melhor o papel dessa enzima, foram realizados testes na ausência das enzimasf CPS-6, e foi observado que o processo de degradação se tornou mais lento, porém, as chances de morte do zigoto foram maiores (ZHOU et al., 2016).
4 .3 - Doenças mitocondriais A primeira doença associada ás mitocôndrias foi a doença de Luft, também conhecida como miopatia mitocondrial, em 1959. Geralmente é
mutações, que se acumulam e geram polimorfismos (WILSON et al, 1995; AZEVEDO, 2005). Através da analise da frequência dessas mutações será possível identificar um grupo e estudar sua estrutura.
Entre as técnicas de biologia molecular que possibilitam a análise do material genético mitocondrial, temos a extração do DNA, feita com protocolos que variam de acordo com a espécie que esta sendo estudada; digestão do mtDNA, utilizando enzimas de restrição, que são empregados de acordo com o fragmento de restrição de interesse; a PCR (Reação em cadeia de polimerase) que tem o intuito que replicar o material genético mitocondrial in vitro; Southern blot, que detecta os polimorfismos de tamanho de fragmentos de restrição (RFLPs) aliado à eletroforese.
Em casos mais complexos, onde o DNA nuclear esta muito degradado, ou as amostras são muito escassas, como em gotículas de saliva e fios de cabelo, por exemplo, torna-se mais viável utilizar o mtDNA para analise (WILSON et al.1995; COBLE et al., 2009) Nessas circunstancias, é empregado na genética forense, comparando o material coletado com o da mãe ou de irmãos da vitima ou suspeito, já que se trata de um material herdado pela parte materna.
4.4.1 - Eva mitocondrial Os marcadores de DNA mitocondrial são amplamente utilizados em estudos de filogenetica, podendo possibilitar e facilitar o mapeamento de árvores evolutivas de espécies e grupos específicos de determinada espécie, o maior exemplo deste mapeamento evolutivo é a „Eva mitocondrial‟ ou „Eva Africana‟; Eva Mitocondrial é o mais antigo ancestral comum da espécie humana, através da técnica RFLPs (Polimorfismo no Comprimento do Fragmento de Restrição) com indivíduos de diversas origens e de origens múltiplas, teve-se um único ancestral comum de dna mitocondrial, uma mulher africana datada com aproximadamente 150 mil anos, contudo, Eva não teria sido a primeira mulher existente, teria sido a primeira com linhagem mitocondrial ancestral similar às demais gerações (RINCON, 2009).
Conclusão:
Acerca do exposto, podemos ver a importância dos genomas extranucleares, herdados de forma uniparental e que atuam na célula em conjunto com o genoma nuclear. Devido á isso temos a importância de que os dois genomas se encontrem em perfeito estado na célula, para assim cooperar com o funcionamento correto do organismo. Em ambos temos a ausência de recombinação, porém mutações ainda ocorrem e podem gerar alguns problemas para o individuo que a possui e seu herdeiro.
Os estudos relacionados á essa área apresentam em sua maioria, temas de estudo de populações, visando entender suas origens, quais grupos a formam, meios de conservação e quais alterações sofreram no decorrer do tempo.
Perspectivas futuras:
O estudo de DNA extranuclear é de grande importância tendo-se em vista toda utilidade que já se existe, é uma área que se deve aumentar os investimentos para que a produtividade em resultados seja também ampliada, a gama de atividades que podem ser realizadas e informações que podem ser extraídas do DNA mitocondrial e plastidial é gigantesca, e tende a ser ainda maior com o desenvolvimento de melhores técnicas de extração e analise destes, principalmente nas áreas de filogeografia e filogenetica.
Com melhores técnicas de extração e analise para o cpDNA as pesquisas referente a estratégias de conservação vegetal para espécies em risco de extinção terão maiores possibilidades de desenvolvimento e sucesso, consequentemente a perda de espécies vegetais irá decair significativamente.
Seguindo a mesma linha do cpDNA, o melhoramento e desenvolvimento em técnicas de análise para o mtDNA amplificará e facilitará o diagnostico de doenças genéticas de cunho mitocondrial, tal como conhecimento sobre a propagação e desenvolvimento das mesmas, ampliará também os resultados obtidos na área de filogenética, otimizando o conhecimento já existente sobre a evolução e derivação animal, vegetal e de forma mais específica derivação e mutação entre grupos de uma mesma espécie ou grupos de espécies.
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