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O dogma central
DNA
RNA
Proteína
Genoma
transcriptoma
Proteoma
mRNA, Genes e Ribossomos
- Em trabalho publicado em 1961 (Brenner et al)
assumiu-se, definitivamente, que a espécie instável
de RNA, era responsável por carregara mensagem
contida na molécula de DNA até os ribossomos
- Denominada RNA mensageiro (mRNA)
- Finalmente estabelecia-se uma conexão entre genes
e proteínas
Transcrição do DNA
- A síntese dos diferentes tipos de RNA, a partir de um
molde de DNA, usando as regras da
complementaridade, é um processo denominado
Transcrição do DNA
- A informação genética contida num segmento do DNA, é
reescrita em uma fita simples de RNA
- Esta fita apresenta uma seqüênciade ribonucleotí dios
complementar a uma das fitas da duplahélice de DNA (fita
molde) e idêntica àidêntica à seq üência da outra fita (fita
codificadora), com substitui ção de T por U
Transcrição do DNA
- Quando se escreve um seqüência de nucleotídios
correspondente a um gene
•A seqüência é sempre escrita no sentido 5'-> 3'
A Unidade de Transcrição
- A transcrição de um segmento se inicia quando a
RNA polimerase reconhece e liga-se a seqüências
específicas de nucleotídios em uma região especial,
no início do gene, denominada promotor
- Além destas seqüências, o promotor engloba o ponto
de início
- Primeiro par de bases a ser transcrito em RNA
- A partir daí a RNA polimerase move-se ao longo do
molde, sintetizando RNA, até alcançar uma outra
seqüência específica que sinaliza o términoda
transcrição
- Assim, a unidade de transcrição estende-se do ponto
de início (+1) no promotor, até o terminador
A Unidade de Transcrição
Diz-se que as seqüências que antecedem o ponto de início localizam-se à
montante (upstream) e as que o sucedem localizam-se à jusante
(downstream)
A posi ção das bases é numerada nos dois sentidos, a partir do ponto de início,
ao qual se atribui o valor +1. Os valores aumentam (valor positivo ) à jusante
e diminuem (valor negativo ) à montante
Reconhecimento do Promotor
- Para que este processo ocorra é necessário, antes
de mais nada, que a RNA polimerase identifique
sinais específicos no DNA, os quais direcionarão a
transcrição de genes específicos no momento
adequado
- A região do gene que contemestas seqüências de
reconhecimento é o promotor
- Uma enorme variedade de sinais pode ser
encontrada nas regiões promotorasde diferentes
genes. É por este motivo que os promotores são
locais extremamente importantes no controle da
expressão gênica
Sítios de splicing
DNA
Splicing
Transcrição
mRNA
intron
exon
receptor
O dogma revisto
Proteína
Síntese proteica
Regulação da expressão gênica
Diferenciação celular
Silenciamento de genes
rRNA -Ribosomal RNA é um componente do ribossomo, sintetiza prote ínas co -fatores na c élula
tRNA – é a um adaptador molecular, carrega a informação, interface entre aminoácidos de uma prote ínas e a
informação do DNA.
mRNA– Rna mensageiro, que codifica e carrega informação a partir do DNA
snRNA- Small nuclear RNA –número de pequenas moléculas de RNA encontradas no n úcleo.
siRNA - Small interfering RNA – induz RNA interferência em organismos
ncRNA– RNA não-codante prov ém de seqüências de transcritos dos quais não codifica prote ínas,
DNA
rRNA tRNA mRNA snRNAsiRNA ncRNA
DNA
rRNA tRNA mRNA snRNAsiRNA ncRNA
- Determinação da função de um gene
- Caracterização de um estádio de desenvolvimento ou
fisiológico
- Caracterização de elementos regulatórios
Por que estudar transcriptoma?
Técnicas disponíveis
- Seleção diferencial e hibridização subtrativa (Sambrook et al., 1989)
- cDNA -AFLP (Bachem et al.,1996)
- Differential Display Reverse Transcription PCR - (DDRT-PCR)
(Liang and Pardee., 1992)
- RFLP-coupled differential display (RC4D) (Fischer et al., 1995)
- Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) (Velculescu et al., 1995)
- Macroarrays (Chen et al., 1998)
- Microarrays (Schena et al., 1995)
ESTs (Expression Sequences Tags)
AAAAAAAAA TTTTTTTTT
RT
PCR
Clonagem
Seqüenciamento
Extração RNAm + Oligo (dT)
cDNA
Extração do DNA/RNA
Figure 1. Approximately
500 mg of Breast Tumor
Tissue Was Prepared
Using the Simultaneous
RNA/DNA Protocol.
The RNA was suspended
in 400 μl RNase-free
water/0.1 mM EDTA. The
DNA was suspended in
200 μl TE. The samples
were run on a 1%, pH 7.
agarose gel for 25 min. at
0.6 V/cm. Lane 1: 1 μg
pUC 19/Sau 3A markers ,
Lane 2: 1 μl breast tumor
DNA, Lane 3: 1 μl breast
tumor RNA, Lane 4: 5 μl
breast tumor DNA.
Figure 1. DNA, RNA, and total nucleic acid (TNA) purified from
diverse cell sources. M = k b ladder
G0 Gp F0 F p
DNA
RNA 28S
RNA 18S
RNA mensageiro
(nuvens)
Gel de agarose 1,5% com 1 μL brometo de etídeo (10 mg/mL)
G0 - Gala sem inóculo; Gp - Gala com inóculo (pool de períodos);
F0 - Fuji sem inóculo; Fp - Fuji com inóculo (pool de períodos)
RNA 5.8S
mRNA
cDNA“ tester“com adaptador 1 R (^) cDNA “Driver”cDNA“tester“comadaptador2R (em excesso)
1 ª Hibridização
a
RNA mensageiro
Subtração
Ligação dos adaptadores
cDNA
Digestão comRsaI
a, b, c, d + e
2 ª Hibridização: mistura de amostras, adição de “Driver” desnaturado eanelamento
Preenchimento dos terminais
d
b
c
a
d
b
c
e (^) Adição de “primers” Amplificação por PCR
a e d - nenhuma amplificação b- b’ - nenhuma amplificação
c - amplificação linear e e -amplificação exponencial
5 ’ 5’
3’
3 ’
Construção de bibliotecas Subtrativas
Tester
RNA tecido A
Driver
RNA tecido B
cDNA
Digestão com Dpn II
Ligação ao oligoA Ligação aooligoB
Hibridização com excesso de Driver
PCR com a utilização de iniciadores complementares ao oligo A
Amplificação seletiva dos cDNAs derivados do Tester
Clonagem em vetores e montagem da biblioteca
1 Kb PCR1 PCR 2 PCR1 PCR 2 PCR1 PCR 2
Bibl. A Bibl. B Bibl. C
Bibliotecas Tester Driver Genes
SSH-A Fuji com inóc (pool) Fuji sem inoc (zero) Induzidos
SSH-B Fuji com inóc (pool) Gala com inóc (pool) Constitutivos/expressos
SSH-C (^) Fuji sem inóc (zero) Gala sem inóc (zero) Constitutivos
O que é clonagem gênica? O que é clonagem gênica?
??^
Tecnologia do DNA recombinante Tecnologia do DNA recombinante
Técnicas de DNA recombinante
Fundamentos:
-Descoberta da enzima de restrição
-Descoberta da DNA ligase
-Vetores de clonagem
-Desenvolvimento de métodos de
transformação
-Desenvolvimento de métodos de
seleção
Técnicas de DNA recombinante
Fundamentos:
-Descoberta da enzima de restrição
-Descoberta da DNA ligase
-Vetores de clonagem
-Desenvolvimento de métodos de
transformação
-Desenvolvimento de métodos de
seleção
Enzimas para clivagem do DNA –
endonucleases de restrição
- Cada vetor é clivado em uma única posição
para abrir o círculo
- 1.200 enzimas de restrição – cliva-se
sequencias de 4, 5 até 8 nucleotídeos
A primeira letra representa o gênero e as
outras duas a espécie, seguido de um
algarismo romano (ou outra letra) que
indica a ordem da descoberta ou a
linhagem da qual ela foi isolada.
Eco RI - é purificada de uma Escherichia
coli que carrega um fator de transferência
de resistência RI,
Hind III é isolada da Haemophilus
influenzae , linhagem d III.
Principais passos da clonagem de genesPrincipais passos da clonagem de genes
1. O vetor funciona como um veículo que
transporta o gene para o interior da célula
hospedeira, normalmente uma bactéria.
2. Dentro da célula hospedeira o vetor
multiplica- se, produzindo numerosas cópias
idênticas não só de si pr óprio, mas també m
do gene que transporta.
3. Quando a célula hospedeira se divide, a sua
descendência recebe cópias das moléculas de
ADN recombinante.
4. Apó s um grande nú mero de divisões
celulares, é produzido uma coló nia ou clone,
de células hospedeiras idênticas.
5. Cada célula no clone contém uma ou mais
cópias da molécula de ADN recombinante. O
gene transportado pela molécula
recombinante é agora conhecido como sendo
clonado.
VETORES
O que são?
Pequenas moléculas circulares que replicam independentemente do DNA
cromossômico
Produzem-se bactérias ou leveduras transgênicas que contêm o gene
desejado, deixando -as depois multiplicarem -se, o que nos permite
obter grandes quantidades dos genes pretendidos.
Fragmento de DNA contendo o gene a ser clonado, é inserido num
elemento genético auto-replicante – plasmídeo – chamado vetor, de
modo a produzir uma "quimera" ou "molécula de DNA
recombinante".
A característica mais importante é que deve ser capaz de se replicar
dentro da célula hospedeira, de modo a que se possam produzir
numerosas có pias de ADN recombinante, sendo estes capazes de
passar para as células filhas.
Comprimento mComprimento mááximo aproximado de DNA que pode serximo aproximado de DNA que pode ser clonadoclonado em vetoresem vetores
Tipo de Vetor DNA clonado (kb)
Plasmídeo
Fago
Cosmideo
P1 Fago
BAC (bacterialartificial chromosome )
YAC (yeast artificial chromosome)
aa aa aa aa aa aa aa aa
Proteína
CTC ATT GTG CTT GAA TTT TTG GTG
DNA
GAG UAA CAC GAA CUU AAA AAC CAC
mRNA
Seqüenciamento de DNA Seqüenciamento de DNA
-OH nos dNTPS
Não forman ligação
fosfodiéster com o próximo
dNTPs que chega na cadeia
Seqüenciamento de DNA Seqüenciamento de DNA Seqüenciamento de DNASeqüenciamento de DNA
ddATP
DNA
DNA polimerase
A, C, G e T
DNA
DNA polimerase
A, C, G e T
ddCTP
Repetidos ciclos de:
desnaturação,
anelamento
extensão
A C T G
AACGGTTCCAC
Interpretação
DNA
DNA polimerase
A, C, G e T
ddGTP
DNA
DNA polimerase
A, C, G e T
ddTTP
PROJETOS GENOMA PROJETOS GENOMA
Breve histórico:
70’s: 20 bases em dois anos
Breve histórico:
70’s: 20 bases em dois anos
Géis de poliacrilamida
Radioisótopos
Géis de poliacrilamida
Radioisótopos
- Seqüenciamento automático
Slab gel
Capilar
- Seqüenciamento automático
Slab gel
Capilar
Sanger Institute
Celera Genomics
Sanger Institute
Celera Genomics
500 bases / segundo 500 bases / segundo
Uso da bioinformá tica na análise genômica
primer polimerase
dNTPs
template
labelled
ddNTPs
Seqüenciamento de DNA Seqüenciamento de DNA
TAGAGCATCGATCGATGCTGCAGATGATGCTAGCATCGGCTAGGCGACG
ATCTCGTAGCTA
ATCTCGTAGCTAGCTACGACGTCTA
ATCTCGTAGCTAGCTA
ATCTCGTAGCTAG
ATCTCGTAGCTAGC
ATCTCGTAGCTAGCT
ATCTCGTAGCTAGCTAC
ATCTCGTAGCTAGCTACG
ATCTCGTAGCTAGCTACGA
ATCTCGTAGCTAGCTACGAC
ATCTCGTAGCTAGCTACGACG
ATCTCGTAGCTAGCTACGACGT
ATCTCGTAGCTAGCTACGACGTC
ATCTCGTAGCTAGCTACGACGTCT
ATCTCGTAGCT
ATCTCGTAGCT
ATCTCGTAGCT
ATCTCGTAGCT
ATCTCGTAGCT
ATCTCGTAGCT
ATCTCGTAGCT
ATCTCGTAGCT
ATCTCGTAGCT
ATCTCGTAGCT
ATCTCGTAGCT
ATCTCGTAGCT
ATCTCGTAGCT
ATCTCGTAGCT
A G C T A C G A C G T C T A
Seqüências
Ano
15 milhões
Crescimento do GenBank
Europeu Japonês
24h
(A)
AUG
Um mRNA & suas ESTs
(A)
(T)
cDNA (fita -) 18
AUG
(A)
cDNA (fita +)
cDNA (fita +)
(T)
cDNA (fita -)^18
(A)
ATG
ATCATGACTTACGGGCGCGCGAT
GGCGCGCGATATCC
AAATTTATTATCC
3’EST
3’EST 5’EST
5’EST
AAATTTATTATCCATCTACG
PCR inespecífico & seu ORESTES
(A)
cDNA (fita -)
AUG
amplicon (fita +)
Iniciador
(60ºC 37ºC)
amplicon (fita -)
amplicon (fita +)
PCR
(60ºC)
ORESTES
AGATCGATCATGACTTACGGGCGCGCGATATCG
GGGCGCGCGATATCGAAAAATTTATAAGGCTAG
CCCCGGCGGCTCGGCCGGGGAGATCGATCATGAC
+ORESTES (outros iniciadores)
montagem
AGATATGAGAGACACAGAAATTTCCG
GACACAGAAATTTCCGATA
ATTTCCGATACAAACCTGGTAAGACAGC
GACAGCTAAGGTTAGGACGACTTTAGGACCGATACCC
TTAGGACGACTTTAGGACCGATACCCCAAATACC
TACCCCAAATACCCTAAGATTA
AAATTTCCGATACAAACCTGGTAAGACAGCTAAGGTTAG
AGATATGAGAGACACAGAAATTTCCGATACAAACCTGGTAAGACAGCTAAGGTTAGGACGACTTTAGGACCGATACCCCAAATACCCTAAGATTA
AGATATGAGAGACACAGAAATTTCCG
GACACAGAAATTTCCGATA
ATTTCCGATACAAACCTGGTAAGACAGC
GACAGCTAAGGTTAGGACGACTTTAGGACCGATACCC
TTAGGACGACTTTAGGACCGATACCCCAAATACC
TACCCCAAATACCCTAAGATTA
AAATTTCCGATACAAACCTGGTAAGACAGCTAAGGTTAG
AGATATGAGAGACACAGAAATTTCCGATACAAACCTGGTAAGACAGCTAAGGTTAGGACGACTTAGATATGAGAGACACAGAAATTTCCGATACAAACCTGGTAAGACAGCTAAGGTTAGGACGACTTTAGGACCGATACCCCAAATACCCTAAGATTATAGGACCGATACCCCAAATACCCTAAGATTA
AGATATGAGAGACACAGAAATTTCCG
GACACAGAAATTTCCGATA
ATTTCCGATACAAACCTGGTAAGACAGC
GACAGCTAAGGTTAGGACGACTTTAGGACCGATACCC
TTAGGACGACTTTAGGACCGATACCCCAAATACC
TACCCCAAATACCCTAAGATTA
AAATTTCCGATACAAACCTGGTAAGACAGCTAAGGTTAG
Contig
? A05 – 30C
AAGTATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGCCCTCCCG
ATGCATGCTCGAGCGGCCGCCAGTGTGATGGATATCTGCA
GAATTC GCCCTTAGCGTGGTCGCGGCCGAGGTACCATTT
AAATGCAAAGGTTGCACACTACTTCTGCCATGCAAAAGA
TTGAAGCAGAAGGTTCAACGGTGAGCTGAAACAGATCAC
TACAGCACGACACCTTTCCATACCACATTCATTATTCCGT
CAACAGCAAAAGTATCCCATATCGTCAAGGTCGAACGTA
CTCTAGATTTGATGGACTTGTTTTGACCCTCAAATTTTTGA
GTCGGCCTTATACTCTGAAGGGCACCAGAAAACCCTCCA
GCACAGTTCAAGAATAAGCCTGTGGAAAGTTACTTCTTCA
AAAGCAAAAGTATCTCATATCATCTCTTATCCATTTGCTTC
TCCTTATCCTGGCAGTTGAATGAGAGACAAGGAGAAGGA
GAACAATCAACCGGAAGCCGAAGTCAAACCTCTGATCTT
GGGTTGCTTACTTGGAAGTTTGACTGCTTACCTTGTCTGTC
ACCTCTTTCGGCAGATCTCTTAGCTCGGCGACTTGGGGGA
CTCCT
