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Determinação de Proteína pelo Método de Biureto
Tipologia: Notas de estudo
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Trabalho Nº 5 Como exigência da discipli- na de Química e Bio- química de Alimentos
Originária do Oriente Médio, a ervilha é muito apreciada em todo o mundo como legume (IAC, 2009), de alto valor nutritivo, com amplas alternativas de uso na alimentação. A princípio, a ervilha era cultivada tanto para forragem quanto como alimento. Na alimentação, era consumida na forma de grãos secos, moídos ou inteiros, ou na forma de grãos verdes. Com o desenvolvimento da indústria de alimentos, foram colocadas em prática formas alternativas de conservação da ervilha. Atualmente, é comercializada de várias formas, como: enlatada, congelada, na forma de farinhas, preparações ou frescas (COUTO, 1989). As cultivares utilizadas para produção de ervilha seca possuem sementes redondas e lisas, podendo ser reidratadas para consumo imediato ou enlatadas. Dos grãos secos pode ser obtida ainda a farinha de ervilha, que tem emprego direto na fabricação de sopas instantâneas e na panificação (PEREIRA, 1989; GIORDANO, 1997). As ervilhas secas destacam-se pela sua riqueza energética, devido ao seu alto teor em hidratos de carbono (essencialmente amido) e proteínas vegetais. O seu teor em gordura não é relevante. A pele das ervilhas é muito rica em fibra, o que lhe confere uma textura dura e rígida. Destaca-se dos restantes legumes pelo seu teor em vitamina B1. É também moderadamente rica em ferro, potássio e cálcio. As ervilhas secas conservam-se muito tempo em local seco, protegido da umidade e da luz direta. Convêm guardá-las num recipiente com fechamento hermético. As proteínas das ervilhas são incompletas, ou seja, não contém todos os aminoácidos essenciais. Desta forma é importante combinar estas leguminosas no prato com proteínas provenientes dos cereais (PETIT, 2009). Nos alimentos, além da função nutricional, as proteínas têm propriedades organolépticas e de textura. Podem vir combinadas com lipídeos e carboidratos (CECCHI, 2001). Para uma indústria de alimentos, quantificar proteínas é importante para controlar a linha de produção industrial de alimentos. Existem, portanto, inúmeros métodos que foram desenvolvidos para determinar a concentração protéica em alimentos. Os métodos diretos baseados em reações colorimétricas, entre eles método de Bradford, Lowry, biureto, ácido bicinchonínico e absorção em ultravioleta (UV) a 280 nm e os métodos indiretos, como os métodos de Kjeldahl e Dumas, são os mais utilizados para este propósito (SIMONNE et al., 1997). O método por biureto foi proposto por Riegler em 1914, baseado na observação de que substâncias contendo duas ou mais ligações peptídicas formam um complexo de cor roxa com sais de cobre em soluções alcalinas. A intensidade da cor formada é proporcional à quantidade de proteína, e a medida pode ser feita num colorímetro. Este método apresenta vantagens: ser bastante específico por não apresentar problemas interferentes; é simples, rápido e barato; por envolver uma reação com a ligação peptídica, o método determina somente proteína. Entretanto, apresenta desvantagens: a necessidade de uma curva de calibração tomada com um padrão conhecido de proteína; a cor formada no complexo não é idêntica para todas as proteínas (CECCHI, 2001) e este método não é muito sensível, como foi destacado por diversos autores (HISCHE et al, 1982; MACART e GERBAUT, 1984; JENZANO, 1986), colocando-o em grande desvantagem, em relação a outras metodologias, e por isto tem sido, ao longo dos anos, substituído por métodos mais sensíveis. O objetivo desta prática foi a determinação de proteína pelo método de biureto em amostra de ervilha seca da marca Yoki.
Após leitura de absorbância da solução padrão de albumina bovina a 540 nm, obteve-se os valores apresentados na tabela a seguir:
Tubo Volume de albumina (mL)
Concentração (mg) Absorbância (nm)
Tabela 1: Absorbância da solução padrão
Para o cálculo da concentração em miligramas, utilizou-se regras de três simples a partir da diluição realizada em 50 mL, como é mostrado a seguir:
Tubo 1: 0,5 g ----- 50 mL a ---- 0,2 mL a = 2 mg
Tubo 2: 0,5 g ----- 50 mL b ---- 0,4 mL b = 4 mg
Tubo 3: 0,5 g ----- 50 mL c ---- 0,6 mL c = 6 mg
Tubo 4: 0,5 g ----- 50 mL d ---- 0,8 mL d = 8 mg
Tubo 5: 0,5 g ----- 50 mL e ---- 1,0 mL e = 10 mg
Com o auxílio do programa Origin, realizou-se um gráfico da curva padrão da absorbância (nm) x concentração da amostra padrão de albumina (mg):
Gráfico 1: Curva padrão de absorbância x concentração da solução padrão de albumina
Obteve-se assim, a equação da reta Y = a + b*X, onde a é o coeficiente linear, b é o coeficiente angular, X é a concentração da amostra e Y é a absorbância da amostra. A equação ficou como a seguir:
Obteve-se também, o valor de R ou regressão linear da reta, sendo igual a 0,9986. Este valor indica o quão perfeito foi o preparo da solução padrão, sendo 1, o valor máximo.
Após leitura de absorbância da amostra de ervilha a 540 nm, obteve-se os valores apresentados na tabela a seguir:
Tubo Volume da alíquota de amostra no tubo (mL)
Absorbância (nm)
Tabela 2: Absorbância da amostra de ervilha
Comparando os valores de absorbância da solução padrão com os valores da amostra, observa-se que a absorbância da amostra de ervilha que mais se aproxima do valor central da curva padrão, é a absorbância do tubo 2, com 0,412 nm comparando-se a 0, nm da curva padrão. Portanto, tomamos como melhor tubo, o tubo número 2 da amostra de ervilha, utilizando este valor de absorbância para efeito do cálculo da concentração de proteína na amostra. Então, a partir da equação da reta:
forma que foi processada, dependendo do tratamento (cozimento, temperatura, conserva, etc.) que sofreu, pode ter havido maior ou menor desnaturação destas, pois, os métodos de processamento modificam a composição e a disponibilidade de nutrientes em relação ao material cru (DELLAVALLE, QUILLIEN e GUEGUEN, 1994; VAN DER POEL, ZUILICHEM e VAN OORT, 1990), e alterações químicas produzidas pelo processo de aquecimento podem também diminuir a assimilação de nutrientes, incluindo a absorção de outros nutrientes (ALONSO, AGUIRRE e MARZO, 2000), ou seja, o teor de proteína depende do produto que foi analisado: se foi ervilha fresca, seca, triturada, farinha, sopa, em conserva, etc.; além de depender do método que foi utlizado para tal determinação, pois existem métodos que são mais ou menos precisos. Como não se sabe o método utilizado por cada autor, não podemos dizer que todos os valores mencinados têm grande precisão, visto que algumas técnicas não oferecem valores analiticamente exatos, sendo este, o caso do método utilizado neste experimento, o método de biureto. Todos os valores apresentados, estão relacionados a produtos derivados de ervilhas e também a ervilha fresca, in natura. Portanto, para fins de comparação, utilizaremos o valor encontrado por Canniatti-Brazaca (2006), que analisou ervilha seca, ou seja, o mesmo produto analisado nesta prática. O autor encontrou o valor de 24,32 ± 0,4%, que é um pouco maior se comparado ao valor encontrado nesta prática (20,31%) e é bem próximo do valor informado pelo fabricante (23%), portanto pode-se dizer que a determinação de proteína pelo método de biureto foi eficiente, visto que valores próximos e aceitáveis foram encontrados. Em relação as diferenças apresentadas, observa-se que elas não ultrapassam 4,5% de diferença em relação a literatura. Este erro pode ser justificado devido à metodologia realizada, pois o método de biureto não é tão sensível por estar sujeito à interferência de substâncias que possam reagir com os íons cobre (II), sendo necessário outras metodologias simultanêas para eliminação deste erro (ZAIA, ZAIA e LICHTIG, 1998); a técnica utlizada por Canniatti-Brazaca (2006) foi diferente da utilizada nesta prática e isto pode ter influenciado neste teor, a espécie analisada por ele também pode ser diferente da analisada em laboratório. Outros erros também se dão à má execução da prática: leituras erradas de absorbância, volumes incorretos de reagentes, pesagens incorretas, etc. Em relação a porcentagem informada pelo fabricante, não podemos dizer que ele está fraudando o produto, pois o valor encontrado na prática (20,31%) foi próximo do referido por ele (23%). Lembrando que, este valor (23%) é uma média e, há erros que possam ter sido cometidos, pode-se dizer que o fabricante está informando adequadamente o consumidor em relação ao teor de proteína apresentado em seu produto.
A partir do que foi discutido, pode-se concluir que o método de biureto apresenta realmente as vantagens expostas, como ser de rápida execução, utilizando de simples metodologia, e que a técnica apresentou valores satisfatórios para a determinação de proteína em grãos de ervilhas secas, apesar de que há autores que afirmam que esta técnica não é tão sensível quantitivamente quanto outras existentes para mesma finalidade. Conclui-se que a amostra analisada possui teor de proteína aceitável, estando de acordo com literatura pesquisada. E que a embalagem também apresentou valor médio próximo ao encontrado no experimento, portanto está adequada também. Com esta prática de determinação de proteínas em alimentos, pode-se aprender um método fácil e de grande utilidade para a vida profissional e acadêmica de um engenheiro de alimentos, visto que é uma análise importante e corriqueira em laboratórios de análises.
ALONSO, R.; AGUIRRE, A.; MARZO, F. Effects of extrusion and traditional processing methods on antinutrients and in vitro digestibility of protein and starch in fava and kidney beans. Food Chemistry, Oxford, v. 68, n. 2, p. 159-165, feb. 2000.
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CARDOSO, E. D. Efeito do Zn e N no conteúdo de aminoácidos, proteína e carboidratos dos grãos de ervilha ( Pisum sativum L.), cultivar Utrillo. UNESP - Ilha Solteira : [s.n.], 2006.
CECCHI, H. M. Fundamentos teóricos e Práticos em Análise de Alimentos. 7ª ed., Campinas: Editora da UNICAMP, 2001.
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PETITCHEF. Ervilha. Publicado em: jun. 2009. Disponível em: <http://pt.petitchef.com/ receitas/ervilha-fid-330999>. Acesso em: 29 mai. 2010.
