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IFRJ – Campus Maracanã Coordenadoria de Biotecnologia Disciplina: Tecnologia das Fermentações Turma: BM Professores: Sérgio Hélio Kling & José Ricardo Hassel Lopes
Relatório de Tecnologia das Fermentações
Técnicas de Quantificação de Células
Avaliação: Critério: Nota: Apresentação Introdução Objetivos Material Utilizado/ Métodos Resultados Discussão Conclusão Referências Bibliográficas Total: Alunos: Alexandre G. Garcez n° 1 Arthur de Lima n° 2 Bruno Oliveira n° 4
Rio de Janeiro, 17 de outubro de 2011. Sumário
Introdução Pág.: 3, 4
Objetivos Pág.: 4
Material Utilizado e Métodos Pág.: 4, 5, 6
Resultados Discussões
Pág.: 6, 7, 8, 9 e 10 Conclusão Pág.: 11
Referências Bibliográficas Pág.: 12
- Introdução
Em Tecnologia das Fermentações ou qualquer outra especialidade que trabalhe com
volume total de suspensão com uma sensibilidade alta, podendo inclusive saber a viabilidade das células através de um corante vital. Turbidimetria é um método óptico, com a utilização de um espectrofotômetro, que tem como princípio o fato de que células, em meio líquido, ficam em suspensão, por terem volumes elevados. Sendo assim, quanto mais turva a amostra, maior é a quantidade de células que ela contem, e com os valores de absorbância é possível saber, com grande sensibilidade, a quantidade exata de células no volume total. A possibilidade de se fazer uma curva de eficiência de crescimento celular através do tempo, ajuda em técnicas fermentativas a escolher o melhor método a se utilizar.
- Objetivos
- (^) Determinar a concentração de células de leveduras numa suspensão usando 4 diferentes técnicas de quantificação.
- Prever, através de cálculos, características como diâmetro médio, volume médio e peso seco médio dessas leveduras.
- Material Utilizado e Métodos
▪ Suspensão de células de leveduras; ▪ Pisete com água deionizada; ▪ Balões Volumétricos de 200, 250 e 500mL; ▪ Pesa-filtro; ▪ Pipeta Pasteur; ▪ Pipetas graduadas de 1, 2 e 10mL; ▪ Tubo de centrifuga graduado de 12 ou 15 mL; ▪ Balança analítica - Eletronic Balance FA 2104N; ▪ Câmara de Neubauer 0,100 mm - Lopik Labor; ▪ Centrífuga - HERMLE Z400; ▪ Espectrofotômetro - UNICAM 5625 UV/Vis.
▪ Estufa regulada a 105°C – Quimis 317.B242; ▪ Microscópio óptico - PZO Wapozawa 94899;
Determinação do volume centrifugado (% de células v/v) Pipetou-se 10 mL de suspensão de células, previamente homogeneizada e transferiu-se imediatamente após a homogeneização para tubo de centrifuga graduado, evitando que elas decantassem antes da pipetagem. Centrifugou-se então, por 15 minutos. Através da graduação presente no tubo de centrífuga observou-se, e anotou-se por fim, o volume de sedimento. Expressou-se o resultado em termos de volume de células/100mL de suspensão.
Determinação de peso seco das células (% de células p/v) Pipetou-se 10 mL de suspensão previamente homogeneizada para pesa-filtro de tara conhecida. Secou-se em estufa a 105 graus Celsius. Determinou-se então, por diferença de peso, o peso seco de células e se expressou os resultados em termos de gramas de células secas/100mL de suspensão.
Contagem de células em câmara de Neubauer Homogeneizou-se a suspensão, transferindo-a imediatamente após a homogeneização para um balão volumétrico de 200mL, diluiu-se em seguida na proporção 1:200 (200x). Com o auxilio de pipeta Pasteur uma alíquota da suspensão diluída foi transferida por capilaridade para câmara de Neubauer. Efetuou-se então a contagem em 5 dos 25 quadrados da câmara. Por fim, expressou-se o resultado em termos de nº de células/ mL da suspensão original com base no seguinte cálculo: Ʃ 5 quadrados x 5 x 10000 x diluição.
Turbidimetria Dilui-se a suspensão 200, 250, 333, 500 e 1000 vezes em balões volumétricos de 200, 250, 500, 500 e 500 mL respectivamente. Leu-se a absorbância das suspensões diluídas a 570nm, utilizando água destilada como branco. Iniciou-se pela de maior diluição,
Diluições Abs – 570nm
200 0,
250 0,
333 0,
500 0,
1000 0,
Paralelo entre resultados Arredondando o valor de % de células v/v podemos dizer que em 100mL de suspensão temos 20mL de células, ou seja, uma concentração de 20mL/100mL. Para traçar um paralelo entre esse valor com os de absorbância devemos pensar primeiramente nas diluições realizadas para cada leitura. Em relação as concentrações em g/v, podemos dividir o valor de 4,4g em 100mL de suspensão pelos fatores de diluição, relacionando esses valores também a absorbância lida. Finalmente podemos saber o número de células correspondentes as absorbâncias lidas em cada diluição, considerando os valores obtidos pela câmara de Neubauer de 1,4 x 10^9 células/mL. chegando aos seguintes valores:
Diluição Absorbância 570nm
Concentração v/v
Concentração mg/v n° de células/mL
200 0,649 1,0 x 10-3^ 22,0^ 7,0 x 10^6
250 0,545 0,8 x 10-3^ 17,6^ 5,6 x 10^6
333 0,446 0,6 x 10-3^ 13,2^ 4,2 x 10^6
500 0,298 0,4 x 10-3^ 8,80^ 2,8 x 10^6
1000 0,158 0,2 x 10-3^ 4,40 1,4 x 106
Através desses valores podemos responder matematicamente as seguintes perguntas:
- Quanto pesa em média uma célula? Realizando uma regra de três com os valores de concentração mg/v e n° de células por mL e fazendo uma média entre eles chegamos a massa de aproximadamente 3,18 pg por célula.
- Quantas células temos em 1g? Realizando as regras de três chegamos a média de 3,2 x 10^8 células/g
- Qual o volume e o diâmetro de uma célula? Através do volume das células/mL (0,2 mL de células/mL) e o número de células (1,4 x 10^9 células/mL) sabemos que o volume de uma célula equivale a 1,5 x 10-10^ mL que equivale a 1,5 x 10-10^ cm³. Sabendo que o volume de uma esfera equivale a 4/3 π r³ chegamos a um diâmetro de 1,4 angstrom.
- Discussão
Determinação do volume centrifugado (% de células v/v) A sensibilidade desta técnica é baixa por conta da impossibilidade de medições precisas através da graduação de uma vidraria de laboratório, temos outros interferentes tais como qualquer outro poluente que possa modificar o volume centrifugado. Sendo assim considera-se que o volume lido é maior do que o volume verdadeiro de células. É possível, através de etapas mais complexas o aumento da precisão desta técnica, onde o uso de reagentes químicos pode servir para extrair alguns tipos de poluentes da suspensão original, todavia esse tipo de
Contagem de células em câmara de Neubauer É uma técnica muito mais sensível que as duas anteriores permitindo quantificar valores de até 10-7^ células/mL, dependendo do tamanho dessas células. Como todas as outras técnicas tem suas limitações. Quando se trata de volumes tão pequenos quanto os colocados em uma câmara de Neubauer qualquer erro de contagem é significativo para o valor final, temos ainda que, caso a câmara não esteja completamente cheia o volume considerado para a conta não será verdadeiro e chegaremos a um número de células errôneo. Há problemas também na contagem de fungos filamentosos ou leveduras aglomeradas, mesmo que tais células possam ser importantes para técnicas fermentativas.
Turbidimetria É entre todas a técnica mais sensível, tendo porém o problema de obter leituras, na mesma faixa do espectro de luz de substâncias coloidais que podem participar da suspensão, sendo um grande fator de erro. Outro seria por conta da rapidez de leitura, já que sabe-se que células rapidamente decantam, o que causaria uma diminuição na absorbância, já que estariam fora do caminho óptico do aparelho.
- Conclusão
Como foi observado nos resultados e discussão apresentados acima, os valores encontrados em prática são bastante semelhantes entre os grupos de laboratório, permitindo dizer que possíveis erros não estão relacionados a metodologia aplica. É possível traçar um paralelo entre vários ensaios laboratoriais de quantificação permitindo encontrar características importantes das células sendo alguns desses importantes para técnicas
fermentativas. A elaboração de gráficos permite a visualização rápida e simplista das relações entre o ensaio de turbidimetria e os valores encontrados em outros ensaios.
- Referências Bibliográficas
Literatura: SCHMIDELL, W.; LIMA, U.A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W. Biotecnologia Industrial: Fundamentos – v. 1 - São Paulo: Edgard Blücher Ltda, 2001. SCHMIDELL, W.; LIMA, U.A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W. Biotecnologia Industrial: Engenharia Bioquímica – v. 2 - São Paulo: Edgard Blücher Ltda, 2001.
