RELATÓRIO-Quantificação celular2, Notas de estudo de Cultura

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Prática: QUANTIFICAÇÃO CELULAR

Alunos: FELIPE RODRIGUES Turma: PMQ 361 Professores: José Ricardo

INTRODUÇÃO

A quantificação celular é de grande importância para o controle do número de microrganismo em determinado processo, está quantificação poderá influenciar diretamente no rendimento de um processo onde as concentrações de certas células são de suma importância. Por exemplo, a concentração da levedura Sacharomyces cerevisiae,um fungo unicelular , que foi quantificada nesta prática, irá influenciar diretamente no processo de produção de cerveja. São vários os métodos de quantificação de microrganismos em uma cultura ou suspensão. Eles se dividem basicamente em dois grandes grupos: quantificação por contagem direta e por contagem indireta. Porém algumas dessas técnicas exigem algumas precauções como a necessidade de diluição para diminuição do número de microrganismos em uma amostra para a viabilização da quantificação de uma população de microrganismos Alguns métodos de contagem direta, como em câmara, são utilizados para a contagem do número total de microrganismos, ou seja, contagem do número de células vivas e mortas, essa técnica apesar de não muito precisa tem um custo relativamente baixo e um resultado rápido. Já outros métodos de contagem direta são utilizados para medir a biomassa microbiana por pesagem direta, entretanto quando se tem um material celular úmido as estimativas obtidas não são precisas, sendo assim necessário a secagem em um forno a temperatura de 105 ºC , chegando assim a um resultado satisfatório. Outro método é por turbidimetria com espectrofotômetro, cujo o qual conta com um auxílio de um instrumento capaz de medir a quantidade de luz que é absorvida ou transmitida quando atravessa uma amostra contida em um recipiente, essa luz transmitida é inversamente proporcional a concentração de células. Além deste método existe também um teste muito rápido e fácil para a quantificação de um volume aproximado de quantidade de biomassa, a técnica de volume de material celular após centrifugação consiste na centrifugação de uma suspensão celular em tubo de centrifuga graduado. A centrifugação deve ocorrer de modo que promovam o empacotamento dos microrganismos sem provocar a ruptura ou a lise celular. O volume de células é obtido por leitura na escala existente no próprio tubo. Outro método também eficiente é a quantificação de forma indireta este se dá pela dosagem de componentes celulares podendo assim fornecer uma avaliação da massa microbiana, ou então pela medida de compostos resultantes da atividade metabólica onde há uma relação entre a massa de material seco que aumenta e a

Fizeram-se diluições de 0,5: 500; 0,5: 250; 1,5: 500; 1: 250; 1: 200; a partir da solução obtida no método anterior. Retiraram-se amostras das soluções obtidas e leram- as no espectrofotômetro para se medir a absorbância à 570 nm. 3) Volume de centrifugado Pipetou-se 10 mL da suspensão previamente homogeneizada e transferiu a para um tubo de centrifuga graduado centrifugando a com velocidade de 3500 rpm por 10 min.

4. Contagem na Câmara de Neubauer: Homogeneizou-se a suspensão e diluiu-a 200 vezes , em seguida com o auxílio de uma pipeta de Pasteur, gotejou-se a suspensão diluída na câmara de Neubauer sendo efetuada aa contagem em 5 dos 25 quadrados.

RESULTADOS

1. Massa seca: PESA FILTRO MASSA INICIAL(VAZIO) MASSA FINAL (+ AMOSTRA SECA) CONCENTRAÇÃO 13 57,3135 57,8187 0,05052 g/mL C=concentração; Ms = massa seca; V= volume C= (Ms/V). Ms = 57,8187 – 57.3135 = 0,5052 g; V = 10 mL C =( 0,5052 g /10 mL) = 0,05052 g/mL de fermento Ms em 100 mL: Ms = 0,05052 g/ mL. 100 mL = 5,052 g de Fermento %Humidade no fermento: % = 100 – (5,052g/15 g).100 = 66,32% de humidade no fermento
2. Turbidimetria: DILUIÇÃO Fdil CONCENTRAÇÃO (mg/100 mL) ABS em 570nm 0,5:500 1000 5,052 0, 0,5:250 500 10,104 0, 1,5:500 333,33 15,156 0, 1:250 250 20,208 0, 1:200 200 25,260 0,

B 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000 7000000 8000000 9000000 0

Concentração (mg/100 mL) X Absorbância

y= 0,0241x + 0,0416; R²= 0,9924; Ci = 0,05052 g/mL = 5052 mg / 100mL C1 =( 5052 mg / 100mL)/1000 = 5,052 mg / 100mL C2 =( 5052 mg / 100mL)/500 = 10,104 mg / 100mL C3 =( 5052 mg / 100mL)/333,33 = 15,156 mg / 100mL C4 =( 5052 mg / 100mL)/250 = 20,208 mg / 100mL C5 =( 5052 mg / 100mL)/200 = 25,260 mg / 100mL

3. Volume de centrifugado: Vc = 2,1 mL, Vs= 10 mL C = (2,1 ml de células/10 mL de suspensão). 100 = 21 mL de células/100 mL de suspensão
4. Contagem na câmara de Neubauer:

Massa de uma célula = g/mL/nºcel/mL = 0,05052/1650000000 = 0,3 pg Cálcúlo do Volume de uma célula: Cv = 21mL/100mL; nºcel/mL = 1.650.000.000 cel/mL Volume de uma célula = Cv/ nºcel/mL = 1,27 pL Cálculo do diâmetro de uma célula: Vcel = (^) π d^2 / d ²=Vcel. 4/ π

D²=1,27. 4 / 3,14 = 1,

Diametro= 1,2 pm

DISCUSSÕES

1. Massa seca: Na quantificação da levedura por massa seca, a partir da massa obtida conseguiu se calcular a porcentagem de massa de levedura no fermento, 33,68%, um valor bem próximo do teórico (algo em torno 30 %). Esse método por ser gravimétrico é bem preciso e relativamente rápido, porém possui algumas limitações que poderão influenciar no resultado final, por exemplo: ao secar a solução a massa seca incluirá também partículas que estavam dissolvidas na solução e que não eram células, esse erro pode ser amenizado centrifugando a solução, descartando o sobrenadante e lavando o precipitado. Outra limitação é o fato de que são quantificadas o número de células totais (células vivas e mortas) o que em alguns processos não ajudará muito.
2. Turbidimetria: A partir da turbidimetria foi possível traçar a curva padrão da Concentração x Absorbância obtendo uma assim a equação y= 0,0241x + 0,0416, a partir da qual pode se saber a concentração de qualquer solução de levedura sendo necessária apenas a leitura de sua absorbância substituindo a na equação em sequencia tendo como resultado a concentração. O resultado apresentou um valor de R² bem próximo de um, quanto mais próximo de um maior a linearidade da curva e menor é o erro. Este erro pode ser agravado usando-se soluções muito concentradas ou cubetas diferentes nas leituras de absorbância. Este método também apresenta limitações, por exemplo; a necessidade de um espectrofotômetro, a dependência da diluição de soluções muito concentradas para que

o acúmulo de células não distorça o resultado da absortividade, comprometendo a linearidade da curva, sendo ele também não capaz de distinguir células viáveis das não viáveis sendo contabilizado o número total de células.

3. Volume de centrifugado: Este método possui um baixo custo e é bem rápido em relação aos outros. O seu resultado não é muito preciso, pois parte de uma medição volumétrica onde alguns erros, a princípio, não podem ser eliminados, como por exemplo: Ao se centrifugar todos os sólidos em suspenção precipitarão incluindo também as impurezas, logo o volume final inclui também o volume de impurezas. Outra desvantagem é que as células por terem formas esféricas acabam por não preencher todo espaço, adicionando ao resultado o volume vazio entre as células. Outro caso é que em algumas soluções o microrganismo continua fermentando e liberando CO2 o que faz com que o centrifugado não se concentre no fundo, dificultando a medição para evitar esse acontecimento deve se alterar as condições ótimas modificando-se normalmente a temperatura. A partir do tamanho do Braço da centrífuga e de sua RPM foi possível o cálculo da FCR(Força centrifuga Relativa)
4. Contagem na câmara de Neubauer: A partir deste método foi possível uma estimativa do número de células contidas em um determinado volume, apesar de ser um valor não muito preciso, é possível estimar o valor de células viáveis com o auxílio de um corante que reja somente com as células vivas. Foi possível relacionar também o número de células com a absorbância, podendo se calcular o número de células em uma solução de concentração desconhecida partindo da equação da reta calculada por regressão linear (y = 7E-08x + 0,0416). A partir dos resultados dos métodos foi possível o cálculo do volume, do diâmetro, e do peso de uma célula, estes valores são aproximados visto que não levam em conta os erros associados a cada método. Em relação aos outras técnicas é um processo mais cuidadoso porém com grande vantagem de se ter a possibilidade de diferenciar células viáveis das não viáveis com o auxílio de um simples corante que células vivas são capazes de oxidar mudando a sua cor. O seu erro na maior parte das vezes esta relacionado