RELATORIO DE AULA PRATICA, Notas de aula de Microbiologia

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INSTITUTO FLORENCE DE ENSINO SUPERIOR

CURSO DE FARMACIA

DISCIPLINA: Microbiologia RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA Discentes:

Técnica de Coloração de Gram

São Luís 2020

1 INTRODUÇÃO

Coloração de Gram A técnica de Gram, mundialmente conhecida como coloração de Gram, é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram em 1884, o qual permite diferenciar bactérias com diferentes estruturas de parede celular a partir das colorações que estas adquirem após tratamento com agentes químicos específicos. O método consiste em tratar sucessivamente um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes violeta de genciana, lugol, etanol-acetona (descorante) e fucsina. As bactérias que adquirem a coloração azul violeta são chamadas de Gram-positivas e aquelas que adquirem a coloração vermelho são chamadas de Gram-negativas. A coloração de Gram é um dos mais importantes métodos de coloração utilizados em laboratórios de microbiologia e de análises clínicas, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras de bactérias. A técnica tem importância clínica uma vez que muitas das bactérias associadas a infecções são prontamente observadas e caracterizadas como Gram-positivas ou Gram-negativas em esfregaços de pus ou de fluidos orgânicos. Essa informação permite ao clínico monitorar a infecção até que dados de cultura estejam disponíveis. É possível a análise de vários esfregaços por lâmina, o que facilita a comparação de espécimes clínicos. As lâminas podem ser montadas de forma permanente e preservadas como documentação. O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido, com um corante primário, o violeta de genciana, seguido de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gram negativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador, adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico, o etanol-acetona. O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo violeta-iodo é removido, descorando as células. Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Grampositivas e provoca a contração dos poros do peptidoglicano,

2 OBJETIVO

-Aprender a preparar esfregaço de bactérias; -Realizar a técnica de Coloração de Gram; -Aprender o fundamento do método de coloração de Gram; -Comparar a estrutura da parede celular das bactérias Gram-positivas e Gram negativas; -Permitir a observação da morfologia bacteriana e fornecer informações a respeito do comportamento do seu material celular diante dos corantes de Gram. 3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Materiais usados:

• Bico de Bunsen;
• Lâminas;
• Alça bacteriológica;
• Microscópio; -Papel toalha; -Alça bacteriológica; -Água destilada; -Fucsina; -Lugol; -Solução Fisiológica 0,9%; -Solução Cristal Violeta; -Álcool- acetona 3.2 Procedimentos: -Preparar esfregaços a partir de culturas de bactérias. -Corar os esfregaços pelo método de coloração de Gram. -Observar ao microscópio óptico, sob imersão e identificar a morfologia destes microrganismos e sua reação frente ao método de Gram.

Coleta das amostras: -Retirou-se uma amostra da parte interna da bochecha com um swab, raspando lentamente; -Preparou-se um esfregaço: passou-se o material contido no swab em movimentos circulares sobre a lâmina; -Dissolveu-se o conteúdo da lâmina com uma pequena porção de soro fisiológico e deixou-se por um minuto e retirou-se o excesso; Preparo do esfregaço: -Pegou-se uma lâmina limpa no recipiente, secou-se e flambou-se rapidamente na chama do bico de Bunsen; -Identificou-se o lado da lâmina onde será feito o esfregaço; -Flambou-se a alça bacteriológica deixou-se esfriar e colocou-se na lâmina uma gota de solução salina fisiológica; -Flambou-se a agulha bacteriológica, deixou-se esfriar, próximo a chama, abriu-se a placa com a cultura teste e tocou-se a colônia escolhida para retirada da amostra; -Esfregou-se o material com movimentos de rotação da alça bacteriológica, para se obter um esfregaço de forma oval, bem fino e uniforme; -Deixou-se secar nas proximidades da chama; -Fixou-se o esfregaço passando a lâmina (lado oposto ao esfregaço) 5 vezes na chama do bico de Bunsen (rapidamente); Em seguida iniciou-se a Coloração de Gram: -Cobriu-se toda a lâmina com solução cristal violeta (corante roxo), e aguardou- se um minuto; -Em seguida lavou-se rapidamente em água destilada; -Cobriu-se a lâmina com solução de Iugol (mordente), aguardou-se por um minuto; -Lavou-se em água destilada; -Inclinou-se a lâmina e gotejou-se álcool-acetona e deixou-se por 1 minuto. -Lavou-se a lâmina rapidamente em água corrente; -Cobriu-se a lâmina com fucsina de gram e aguardou-se 30 segundos; -Lavou-se em água destilada e usou-se papel filtro para secar (batendo sem esfregar);

1. Ribeiro MC, Soares MMSR. Microbiologia prática: roteiro e manual; Atheneu; 1993; 5-8pp. ANEXOS:

IMAGENS DA AULA PRÁTICA