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1 INTRODUÇÃO
1.1 Contagem total de micro-organismos aeróbios mesófilos
Os microrganismos estão intimamente associados com a disponibilidade, a abundância e a qualidade do alimento para consumo humano. Alimentos são facilmente contaminados com microrganismos na natureza, durante manipulação e processamento. Após ter sido contaminado, o alimento serve como meio para o crescimento de micro-organismos. Se esses micro- organismos tiverem condições de crescer, podem mudar as características físicas e químicas do alimento e podem causar sua deterioração. Os micro-organismos no alimento podem também ser responsáveis por intoxicações e infecções transmitidas por alimentos (Pelczar Jr. et al., 1997). Micro-organismos indicadores são, segundo Franco & Landgraf (1996), grupos ou espécies de micro-organismos que, quando presentes em um alimento, podem fornecer informações sobre a ocorrência de contaminação de origem fecal, sobre a provável presença de patógenos ou sobre a deterioração potencial do alimento, além de poderem indicar condições sanitárias inadequadas durante o processamento, produção ou armazenamento. De acordo com, Silva et al. (2001), O método de contagem de micro-organismos em placas é um método geral, que pode ser utilizado para contagem de grandes grupos microbianos, como aeróbios mesófilos, aeróbios psicrotróficos, termófilos, bolores e leveduras, variando-se o tipo de meio, a temperatura e o tempo de incubação.
Por este método, Jay (1998) e Swanson et al. (1992), explicam que amostras de alimentos são homogeneizadas, diluídas em série, em diluente apropriado, plaqueadas com ou sobre um meio de agar apropriado e incubadas, após o que todas as colônias visíveis são contadas, ou seja, o procedimento se baseia na premissa de que cada célula microbiana presente em uma amostra irá formar uma colônia separada e visível, quando fixada com meio que lhe permita crescer.
Franco & Landgraf (1996) relatam que essa metodologia é, certamente a mais utilizada nos laboratórios de análise de alimentos, pois diferentes grupos de microrganismos podem ser enumerados de acordo com o meio de cultura e/ou as condições de incubação (tempo, temperatura e atmosfera) empregadas.
1.2 Técnica de coloração de Gram
Como é difícil observar as bactérias ao microscópio, pela sua transparência, a utilização de
corantes é extensamente empregada em microbiologia. Os processos de coloração são usados para evidenciar a estrutura geral, ou alguma particularidade da estrutura dos micro-organismos,
auxiliando sua identificação. A coloração mais importante e mais amplamente utilizada é o
método diferencial de Gram. Esta técnica foi descrita por Cristian Gram em 1884, na Dinamarca (BARBOSA et al.,2005).
Segundo este mesmo autor, Barbosa et al (2005), neste processo, um esfregaço fixado recebe o
seguinte tratamento:
- Solução de cristal violeta (ou violeta-de-genciana).
- Solução de lugol – atua como mordente, isto é, fixador de corante.
- Solução de etanol – é o passo crítico de diferenciação, já que um grupo de bactérias sofre descoloração pelo álcool e outro, não.
- Solução de safranina (ou fucsina).
No final da coloração, as bactérias apresentam-se roxas ou vermelhas. As primeiras apresentam a cor roxa porque tiveram o complexo violeta-lugol e não se descoloriram pelo etanol. São as bactérias gram-positivas. As segundas devem sua cor vermelha ao corante de fundo, a safranina, já que não conservaram a coloração do complexo violeta-lugol. Constituem as bactérias gram-negativas.
Com base no exposto, o presente relatório teve como objetivo a contagem total de micro-
organismos aeróbios mesófilos em amostras de arroz, feijão, fiambre e creme de galinha e visualizar os micro-organismos presente nas placas por meio da técnica de coloração de Gram.
3.1.1 Materiais
- Diluente: 225 mL de solução salina a 0,85% ou água peptonada 0,1%
- Tubos de diluição: 3 com 9 ml de solução salina ou água peptonada.
- Pipetas
- (^) Balança analítica
- Béqueres
- Erlenmeyers
- Espátulas.
- Micropipetas
- Lamparina
- Meio de cultura: 200ml de ágar padrão para contagem PCA.
- Amostra de 25g de arroz.
- Coleta e análise das amostras
Foram coletadas aleatoriamente, uma amostra de arroz cozido, feijão, fiambre e creme de galinha preparadas no dia anterior. As amostras forma transportadas até o local das analises sem conservação adequada.
Foi pesado 25g de arroz e transferido para Erlenmeyer contendo 225ml de diluente e homogeneizado por aproximadamente 1 minuto. Essa diluição inicial é de 10 -1^. Para a segunda diuição, foi transferido assepticamente e próximo da chama da lamparina 1,0 ml da primeira diluição para 9,0 ml de diluente contido em um tubo de ensaio, com o auxílio de uma micropipeta calibrada. As diluições subsequentes, foram obtidas de maneira similar até obtermos a terceira diluição.
Para inoculação e incubação, foram usadas no total 6 placas de petri esterilizadas e divididas em 3 grupos de 2 cada. Cada grupo de placas foram marcadas com as seguintes identificações: 10-1^ , 10 -2^ e 10 -3^. Para evitar o excesso de uso de várias micropipetas, a inoculação começou da terceira diluição (10 -3^ ) até a primeira (10-1^ ). Pipetou-se 0,1 ml de cada
diluição, nas suas respectivas placas de petri, tomando o cuidado de abrir a placa o suficiente para inserir a micropipeta. Em seguida, foram feitas a homogeneização com o auxílio da alça de Drigalski e foram levadas as placas já inoculadas para uma estufa calibrada a temperatura de 35° C por 48 horas mantendo as placas todas invertidas e empilhadas.
3.2 Coloração de Gram
3.2.1 Materiais
- Placa de petri contendo a terceira diluição (10-3^ )
- Lâminas
- Alça e agulha de platina
- Microscópio óptico
- Corante cristal violeta
- Lugol
- Álcool etílico
- Corante fucsina de Ziehl-Neelsen
3.2.2 Procedimento
Foi feito um esfregaço da terceira placa de petri (diluição 10 -3^ ) em uma lâmina com o
auxílio da capela e próxima a chama de uma lamparina. O esfregaço foi coberto com cristal
violeta (1° corante) por cerca de 1 minuto. Foi escorrido o corante para retirar o excesso, e
então, foi coberto com lugol (mordente) por 1 minuto. A lamina foi lavada com água destilada
e, em seguida, foi descorado com solução de álcool etílico por 5 segundos. Foi novamente
lavado com água destilada. O esfregaço foi coberto com fucsina de Ziehl-Neelsen 1:10 (2°
corante) por 30 segundos. Lavado mais uma vez com água destilada e deixado secar
espontaneamente. Por fim, a lâmina foi levado ao microscópio para ser observado.
organismos mesófilos aeróbios podem indicar necessidade de melhorar os níveis de higiene ou mesmo as condições de armazenamento. A legislação estipula 10^3 como tolerância (BRASIL, 2001).
O creme de galinha apresentou valores da ordem de 1,7x10 4 UFC/g. Pela legislação vigente pratos
prontos para o consumo (alimentos prontos de cozinhas, restaurantes e similares) a base de carnes tem limites padrões de 2x10 UFC/g (BRASIL,2001).
A qualidade microbiológica de um alimento tem relação, principalmente ao tipo e quantidade de micro-organismos, em seguida à capacidade de multiplicação. Esses fatores dependem das condições de higiene não só da matéria-prima, mas dos manipuladores, ambiente e superfícies além dos parâmetros intrínsecos e extrínsecos.(HOFFMANN,2001).
Tabela 2. Resultados da visualização através da coloração de Gram
Amostra Cor/Forma
Arroz Roxa* e vermelha**/ cocos
Feijão Roxa/cocos
Fiambre Roxa e vermelha/cocos
Creme de galinha Roxa/cocos e bacilos
Vermelha/cocos
*gram - positivas / ** gram- negativas
As pequenas dimensões das bactérias fazem com que sua forma seja visualizada apenas grosso
modo ao microscópio óptico. Os cocos são normalmente redondos, mas podem ser ovais, alongados
ou achatados de um dos lados. Os bacilos, por sua vez, podem apresentar-se com as duas dimensões
bastante diferentes, indo desde coco-bacilo (que tem largura e comprimento muito semelhantes,
quando observadas em microscópia óptica) até células filamentosas. (BARBOSA et al.,2005).
Conforme a tabela 2, as amostras de arroz e fiambre apresentaram colônias de bactérias em forma de cocos gram positivas(roxo) e gram negativas(vermelha). Nas análises feitas no feijão, foram observadas apenas bactérias gram positivas em forma de cocos. Nota-se também, que há presença de micro-organismos em forma de cocos em todas as amostras e apenas o creme de galinha possui micro- organismos na forma de bacilos.
5 CONCLUSÃO
- As análises feitas demonstram que todas as amostras estão contaminadas com micro- organismos, entretanto, não determina se os micro-organismos são patogênicos.
- A amostra de arroz demonstrou ser a mais contaminada, podendo ter relação com condições de armazenamento ou problemas na manipulação.
- Foram identificadas bactérias gram-positivas e gram-negativas na forma de cocos e bacilos.
