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- Transmissão viral 3
- O vírus da hepatite C 3
- O genoma do HCV 5
- A replicação do HCV 7
- A heterogeneidade do HCV 8
- Os genótipos do HCV 10
- Aspectos patológicos da hepatite C 11 8.1. Hepatite C aguda 11 8.2. Hepatite C crônica 11 8.3. Cirrose e Hepatocarcinoma 13
- Metodologias de detecção da infecção do HCV 14 9.1. Detecção do ácido nucléico viral (RNA) do HCV no soro 14 9.2. Genotipagem 15 II. Objetivo 18 III. Materiais 19
- Extração e Purificação de RNA Viral e Síntese de cDNA por Transcrição Reversa 19
- Amplificação pela Técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) 20 IV. Métodos 22
- Amostragem ......................................................................... ........................................................................ 22
- Extração e Purificação de rNA viral e síntese de cDNA por Transcrição Reversa ............................... 22 2.1.Extração 22 2.2. Síntese de cDNA ......................................................................... ..............................................................
- Amplificação via Técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) 23 3.1. Primeiro PCR (first round) 23 3.2. Segundo PCR (Second round) ......................................................................... ........................................ 23
- Eletroforese de DNA ......................................................................... .......................................................... 24
- Hibridização Reversa (LiPA) 25 V. Resultados 26
- Amostragem 26
- Amplificação via Nested-PCR qualitativo 26
- Genotipagem via LiPA 27 Genótipos principais encontrados 30 Subtipos do genótipo 1 encontrados 30 VI. Discussão 31 VII. Conclusão 33 VIII. Referências 34
I. Introdução
- Histórico
Hepatite é a palavra usada para definir inflamação dos tecidos do fígado, causada por diferentes agentes como vírus, protozoários, álcool, medicamentos e doenças auto-imunes, entre outros. Com a identificação dos agentes etiológicos causador da hepatite A (Feinstone et al; 1973) e da hepatite B (Bluberg et al., 1965), na metade dos anos 60 e início da década de 70, tornou-se possível o
desenvolvimento de testes sorológicos para detecção destes vírus. No entanto até no meado dos anos 80 uma parcela de pacientes continuava com o diagnóstico indefinido, onde cerca de 90% eram casos de hepatite pós- transfusional sem evidência de marcadores sorológicos por ambos os vírus ou qualquer outro agente hepatotrópico conhecido ( Aach RD et al., 1978; Dienstag JL et al., 1986). A partir destes achados, foi introduzida a denominação hepatites não-A e não-B (NABH) (Knodell RG et al., 1975). Inicialmente a hepatite não-A e não-B foi considerada pouco agressiva mas logo estudos sobre a doença associada à transfusão demonstraram que, além de serem propensas a cronicidade, a hepatite não-A e não-B poderia progredir para cirrose e até levar a falência hepática (Korertz RL et al., 1976; Regenstein F., 1994). Uma vez reconhecida como uma doença hepática importante, inúmeros esforços foram feitos para determinar o agente causador da hepatite não-A e não-B (Shih JW et al., 1986). Ainda nos anos 70, um modelo animal em chimpanzés foi utilizado para demonstrar a infecção após administração de vários inóculos humanos, comprovado a transmissão parenteral da hepatite não-A e não-B (Tabor E et al., 1978; Wyke RJ et al., 1979). Entretanto, a visualização e o isolamento do vírus não foram possíveis devido aos baixos títulos encontrados nas amostras de sangue e tecido hepático dos animais infectados (Bradley, DW et al., 1980). Dada esta dificuldade de isolamento do vírus por metodologia convencional e também a utilização de ensaios imunológicos, novas tecnologias foram introduzidas para identificação do ácido nucléico deste agente. Assim, em 1989, após 15 anos de exaustivos trabalhos, um grupo de pesquisadores dos Estados Unidos (Choo et al.,1989), identificou um dos vírus causadores de hepatite não-A e não-B. Essa determinação só foi possível a partir do uso das técnicas de clonagem molecular usadas em uma cepa isolada de chimpanzé experimentalmente infectado. Os clones obtidos foram posteriormente utilizados em testes sorológicos para determinação de anticorpos (Choo et al., 1989), achando assim o vírus da hepatite C (HCV), o agente causador da hepatite C. Atualmente o vírus da hepatite C (HCV) é responsável por 8 a 10 mil mortes por ano nos Estados Unidos. Calcula-se que há cerca de 100 milhões de indivíduos infectados por este agente em todo mundo. No Brasil, os números são também bastantes significativos, dando uma perspectiva em torno de 12% de anti- HCV positivo (Mendes, 2000). Cerca de 70-80% dos indivíduos infectados pelo HCV desenvolverão a forma crônica da doença. Destes, aproximadamente 20% evoluem para cirrose. A cirrose relacionada ao HCV é atualmente a principal indicação de transplante hepático. Além disto, a infecção pelo vírus da hepatite C é associada a um grande número de manifestações extra hepáticas, como as criobulinemias e as glomerulonefrite, entre outros (Nabuco, 2000). Na grande maioria das vezes a doença é assintomática, o que dificulta no seu controle e facilita sua disseminação na comunidade. O diagnóstico é em geral acidental, durante triagem sorológica em doações de sangue, ou avaliação da possível causa de transaminases alteradas, evidenciadas em exames de rotina. A taxa de resposta sustentada com interferon-alfa usado isoladamente situa-se ao redor de 25%. O tratamento utilizado é administração do interferon alfa associado a ribavirina, entretanto, a taxa de resposta se situa em torno de 50% enquanto que a resposta sustentada ao uso de interferon alfa, isoladamente, situa-se ao redor de 25% (Oliveira, 2000).
- Transmissão viral
é clivada, durante e após a tradução, por proteases celulares e virais para formação dos peptídeos individuais do HCV. A região codificante, que representa 95% do genoma viral, é dividida em duas partes, a dos genes estruturais, que cobre aproximadamente um quarto da região 5’ terminal, a dos genes não estruturais, que cobre cerca de três quartos da região 3’ terminal. Figura 2.
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Figura 2: Representação esquemática do RNA do HCV. Proteínas Estruturais: C, E1 e E2. C- Proteína do capsídio. E1 e E2- Proteínas do envelope. Proteínas não- estruturais: NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5. NS2- Protease Transmenbrana. NS3- Protease e Helicase. NS4a-Cofator. NS4b- ?. NS5a- Fosfoproteína. NS5b- RNA polimerase RNA dependente.
Os genes estruturais levam a codificação de três proteínas: A proteína C, ou proteína do core, de 191 aminoácidos, que constitui o nucleocapsídio viral, sendo uma proteína básica contendo vários epítopo para células B (Carvalho, 2001), as outras duas proteínas E1, de 192 aminoácidos, e a E2, que codifica uma proteína de 426-432 aminoácidos. Essas duas proteínas vão constituir o envelope e ao contrário da proteína core, contém vários sítios de glicosilação. As proteínas do envelope viral contêm vários epítopos para células B, inclusive epítopos para anticorpos neutralizantes, sendo importantes, portanto, para a resposta imune humoral (Carvalho, 2001). A proteína E possui duas regiões que exibem uma alta variabilidade genética entre diferentes isolados e mesmo entre subpopulações de um mesmo isolado (chamado quasispecies). Estas são as regiões hipervariáveis HVR1 e HVR2. A HVR1 é expressa na superfície viral e sua seqüência altamente heterogênea é provavelmente providencial para o vírus, uma vez que anticorpos neutralizantes dirigidos para epítopos desta região reconhecem
- e de fato, neutralizam determinadas subpopulações virais, mas as quaispecis que não são mais reconhecidas pelos anticorpos neutralizantes permitem que o vírus escape da resposta imune h umoral. Os genes não estruturais codificam seis codificam seis proteínas importantes e essenciais para a replicação viral: a NS2 de 197 aminoácidos; a NS3 de 651 aminoácidos; NS4a de 54 aminoácidos; a NS4b de 261 aminoácido; a NS5a de 447- 470 aminoácidos e a NS5b de 591 aminoácidos (Grakoui et al., 1993). A proteína NS3, é uma serina protease com atividade de clivagens nas junções NS3/NS4, NS4a/NS4b, NS4b/NS5a e NS5a/NS5b. A extremidade carbóxi-terminal da região NS codifica para helicase, cuja atividade é separar as fitas de RNA que vão sendo produzidas, e atua tanto na extremidade 3’, na formação da fita simples de RNA negativa que servirão de molde para síntese de novas fitas positivas, como na extremidade 5’, para a produção de fitas positivas. Outra proteína importante no processo de replicação é a NS5b, que tem atividade de RNA polimerase RNA dependente, permitindo a extensão da fita complementar negativa. Pouco sabe-se sobre a função da região NS5a, contudo estudos tem demonstrado que a incidência de mutações na região, estaria associado à maior sensibilidade ao tratamento antiviral. Em 1995 e 1996, Enomoto e colaboradores, demonstraram que 4 ou mais trocas de aminoácidos entre os códons 2209 e 2248 da proteína NS5a tem (tipo mutante HCV-J), comparada com o protótipo HCV-1b, são relacionadas com resposta imunológica sustentada á terapia com interferon-alfa em pacientes japoneses infectados com isolados do HCV-1b. Estes achados foram confirmados por outros estudos
no Japão, contudo, a importância dessa região para região para resposta virológica (região determinante de sensibilidade ao interferon ou ISRD) tem sido desafiada por outros estudos no ocidente –uma vez que a maioria dos pacientes com resposta virológica sustentada tiveram menos que 4 substituições de aminoácidos na região NS5a 2209-2248 (Khorsi et al., 1997; Zeuzem et al., 1997; Squadrito et al., 1997; Sáiz et al., 1998; Rispeter et al., 1999). Em relação as duas extremidades não codificantes, a região 5’ de aproximadamente 342 nucleotídeos, representa seqüência mais conservada do genoma (Bukh et al., 1992), o que favorece a detecção do RNA do HCV a partir da técnica de detecção de ensaios moleculares (Okato et al., 1990). Essa região forma estruturas secundárias contendo quatro grampos (4 stem loops) e tem dois elementos de seqüência importantes para replicação e síntese de proteínas. O loop 40 apresenta atividade de IRES (sítio interno de entrada de ribossomo), onde vão interagir varias proteínas do hospedeiro. E o segundo elemento é o códon de iniciação AUG que dá início de tradução da poliproteína. A região 3’ não codificante com cerca de 170-250 aminoácidos é dividida em três partes: uma de aproximadamente 40 nucleotídeos, imediatamente seguinte ao último códon da região codificante; uma parte polipirimidínica (poli-U) com cerca 98 nucleotídeos, e uma parte formada por aproximadamente 45 nucleotídeos que parece formar uma estrutura estável em forma de grampo (Kolyhalov et al., 1996; Tanaka et al., 1995; Tanaka et al., 1996; Yamada et al., 1996; Blight and Rice et al., 1997). A parte polipirimidínica varia de acordo com o isolado de HCV, sendo os nucleotídeos com base nitrogenada uracila substituídos por outra base nitrogenada citosina (C) ou guanina (G) (Miyakawa et al., 1997).
- A replicação do HCV
A replicação é iniciada na extremidade 3’ do RNA, a partir do qual é sintetizada uma fita complementar de polaridade negativa (intermediário replicativo), o qual servirá de molde para a síntese novas fitas RNA de polaridade positiva. A tradução da poliproteína codificada pela fita positiva é iniciada na extremidade 5’ onde está localizado o sítio interno de ligação ao ribossomo (IRES) e a metionina inicial. A replicação e a tradução virais são processos relacionados)Figura 3 (Van Doorn, 1994; Lau,1996).
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Figura 3: Ciclo replicativo do HCV. Adsorção do HCV no receptor GAG da membrana do Hepatócito. Internalização do vírus por endocitose. Fusão da membrana do vírus com endossomo, liberando o material genético
- A heterogeneidade do HCV
O HCV, como todo vírus de RNA, apresenta alta heterogeneidade genética, ou seja, um alto grau de variação na seqüência nucleotídica. A comparação de seqüências nucleotídicas de isolados virais obtidos de um mesmo hospedeiro, num período de 13 anos (Ogata et al., 1991) revelou que o HCV apresenta uma alta taxa de substituição de nucleotídeo na ordem de 10 - substituição por sítio de nucleotídeo, por ano, muito similar aos outros vírus de RNA de fita simples. Durante a replicação, a RNA polimerase introduz erros na seqüência de nucleotídeos durante a extensão da fita negativa. Os erros são proveniente da própria natureza da enzima que apresenta habilidade proof-reading ou correção, como as DNAs polimerases.
