TÉCNICAS DE ANÁLISIS BIOQUÍMICO I CURSO 2011-12
DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN
Emisión de fluorescencia
13.- La fluorescencia del “blanco” (tampón) es de 11.2
La emisión de la muestra “problema” (con concentración C ng/mL) es 67.0, por lo que su emisión
neta es: 67.0 – 11.2 = 55.8
2 mL de muestra “problema” (C ng/mL) + 1 mL de estándar (3 ng/mL) dan una emisión de 92.0, y su
emisión neta es: 92-11.2 = 80.8
En esta última muestra la concentración es 2 x C/3 + 1 x 3/3 ng/mL
La emisión debida a la muestra problema será (2/3) x 55.8 = 37.2
Por tanto, la emisión debida al estándar (C = 1 ng/mL) será: 80.8 – 37.2 = 43.6
Por ello, la concentración de metabolito en la muestra problema será: 55.8/43.6 = 1.28 ng/mL
14.- T% = 80 = (I/I0) x 100 en cubeta de 1 cm de paso óptico
A = log(I0/I) = log(1/0.80) = 0.097 en cubeta de 1 cm de paso óptico
A = 0.048 en cubeta de 0.5 cm de paso óptico efectivo
Factor de corrección = 10 0.048 = 1.118
Emisión de fluorescencia corregida: 0.95 x 1.118 = 1.062
15.- A275 (1 cm) = 0.230
Paso óptico efectivo en fluorescencia = 0.2 cm
A280 (efectiva) = 0.046
Factor de corrección = 10A280 (efectiva) = 1.112
Fcorregida = Fobservada x Factor de corrección Fcorregida = 0.773
16.- Al representar F vs. C de proteína se obtiene la gráfica
adjunta (círculos). Conocido el valor de E0.1%(280, 1 cm) de la
proteína, 3.4, y su masa molecular (M = 170 kD), se puede
calcular la absorbancia efectiva (0.2 cm paso óptico
efectivo) a 280 nm en las medidas de emisión de
fluorescencia. Con estos valores, para cada concentración,
se puede calcular la Emisión corregida. La representación
de estos valores (cuadrados) pone de manifiesto que se
recupera linealidad. Interpolando en esta gráfica el valor
corregido, se puede calcular la concentración.
C = 0.64 M
17.- El espectro 1 (excitación a 275 nm) muestra la
contribución de Tyr y Trp
El espectro 2 (excitación a 295 nm) sólo emisión de Trp
El espectro 3 (excitación a 295 nm, y normalizado a emisiones superiores a 380 nm) sólo emisión de
Trp pero en unidades comparables a las del espectro 1
El espectro 4 (espectro de diferencia calculado como espectro 1 menos espectro 3) muestra la
emisión de Tyr
Los espectros 3 y 4 representan las contribuciones de Tyr y Trp en la proteína estudiada.
M proteína
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
emisión
0
100
200
300