TÉCNICAS DE ANÁLISIS BIOQUÍMICO I CURSO 2011-12
AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN
Ultracentrifugación
27.- s = M x D x (1 – ρ x ū)/R x T (Ecuación de Svedberg)
2.3 x 10-13 seg = M x 9.75 x 10-7 cm2 s-1 x (1- 0.998 g cm-3 x 0.738 cm3 g-1)/8.31 x 107 erg mol-1 K-1 x
293 K
1 erg = 1 g cm2 seg-2 M = 21800 Da
28.- RCF = 500000 g
ω2X = 500000 x 980 cm/s2 = 49 x 107 cm/s2
X = 6.2 cm ω2 = 79032258.06 s-2 ω = 8890 s-1 = Y rpm x 2 π /60 rad s-1 85000 rpm
29.- ω1 = 100000 rpm = 100000 x 2 π /60 rad s-1 X1 = 5 cm
ω12X1 = 5.48 x 1010 cm s-2
ω2 = 60000 rpm = 60000 x 2 π /60 rad s-1 X
2 = 14 cm
ω22X2 = 5.53 x 1010 cm s-2
En ambos casos el campo centrífugo es prácticamente el mismo
s = (1/ ω2X) dX/dt dX/X = ω2 s dt lnX = ω2 s t + k
Iguales condiciones de centrifugación implicaría: ω12 t1 = ω22 t2 porque una misma molécula habría
recorrido la misma distancia
(15000 x 2 π)2 50 = 1.125 1010 4 π2 (25000 x 2 π)2 18 = 1.125 1010 4 π2
Son condiciones idénticas de centrifugación
30.- Los valores obtenidos se refieren a los
correspondientes a contenido en proteína total,
al objeto de lograr su normalización. Efectuado
este cálculo, resulta fácil identificar, cada una de
las cinco fracciones a partir de los
correspondientes marcadores:
(S-1) núcleos, (S-2) mitocondrias, (S-3)
lisosomas, (S-4) microsomas, y (Sob) fracción
soluble.
De esta manera se puede concluir que la enzima problema está localizada en la fracción soluble
celular.
31.- En un gradiente isocinético, la velocidad de
desplazamiento de cada molécula es constante y
proporcional a su coeficiente de sedimentación. Por ello,
representando (S) frente a la distancia recorrida (fracción
en la que se recoge) debe observarse una dependencia
lineal. Interpolando la fracción 36 en la gráfica obtenida,
se obtiene el coeficiente de sedimentación de la proteína
problema. S = 8.2 S
32.- Representando absorbancia a 260 nm y
densidad frente a la posición correspondiente en el
gradiente, se puede deducir que la muestra de DNA
“flota” a una densidad de 1.67 g cm-3.
θ = 1.67 g cm-3