¡Descarga Caracterització estructural de macromolècules Espectrosco y más Apuntes en PDF de Bioquímica solo en Docsity!
9. Caracterització estructural de macromolècules:
Espectroscopia: és la manera d’estudiar com la llum interacciona amb la matèria.
*Estudi de la interacció entre la radiació i la matèria com una funció de longitud d'ona. Interacció de la radiació i la matèria pot donar lloc a diferents fenòmens que poden ser observats i seguits de moltes maneres diferents. El terme espectrometria s'utilitza per descriure les tècniques d’espectroscòpi utilitzats per avaluar la concentració o quantitat d'una espècie química donada.
No té res a veure una radiació ionitzant de raig X amb una flourescència.
En el nostre cas entendrem com a matèria les biomolècules.
L’espectrometria és la tècnica que s’utilitza per mesurar algun tipus de paràmetre.
Una elevada freqüència vol dir elevada E.
I sabem que la V és inversament proporcional a ƛ.
Per poder veure un àtom necessitem molta energia i una longitud d’ona molt petita.
La llum visible es la radiació electromagnètica de longitud d’ona entre 400 i 700nm, que es una petita part de l’espectre electromagnètica. L’energia d’un fotó individual és major en el extrem violeta de l’espectre que en el vermell; longituds d’ona menors (i major freqüència) equivalen a una major energia (donava per l’equació de Planck).
Nosaltres podem veure la llum visible, podem veure allò que és visible o més gran, MAI més petites, no hi ha interacció.
EL PRINCIPI BÀSIC DE L’ESPECTROMETRIA D’ABSORCIÓ
E= h·V
C= ƛ·V
La diferència entre el que entra i el que surt és l’absorbància, que és proporcional a la concentració.
La transmitància és la magnitud que expressa la quantitat d’energia que travessa un cos per unitat de temps. (potència).
La relació entre l’absorbància i la transmitància no és lineal El logaritme negatiu en base 10 de la transmitància sí és lineal amb la concentració.
ABSORBÀNCIA: quantitat d’intensitat de la llum que absorbeix una mostra. És adimensional.
I 0 = intensitat de la radiació que arriba al detector després de passar per un material que no absorbeix o és transparent a la radiació incident, generalment s’utilitza el blanc de reactius.
I = intensitat de la radiació que arriba al detector després de passar per la mostra.
ε= coeficient molar d’extinció.
Un espectre: mesura d’absorció en els rangs de longitud d’ona
En el cas dels àcids nucleics absorbeix a 260nm.
Les cèl·lules còniques dels ulls són capaces de detectar les que tenen la longitud d’ona dins la llum visible.
La localització a dins o a fora fa variar l’absorbància.
(Recordar l’absorbància dels aa: tirosina i triptòfan; i la dels àcids nucleics) (tema de les proteïnes).
La florescència és la tècnica que serveix per estudiar què passa quan hi ha alguna cosa que s’activa, com una reacció.
ABSORBÀNCIA VS FLOURESCÈNCIA
Veiem dues gràfiques absorbància vs fluorescència. Són molt semblants.
En l’absorbància hi ha un sol salt d’energia. Quan s’absorbeix un fotó s’eleva un electró de la molècula que l’absorbeix (cromòfor) a un nivell energètic superior. Per ser
La quantitat de llum absorbida depèn de:
El tipus de substància per la que travessa la llum. La distancia que recorre. La concentració de la substància.
*La molècula absorbeix a una longitud determinada i emet a una superior per tornar a l’estat basal; d’energia inferior.
Sempre hi ha pèrdues, mai tornem l’energia que s’ha emès.
-APLICACIÓ DE ESPECTROMETRIA DE FLUORESCÈNCIA:
FRET: fluorescences ressonance energy transfer.
Això s’utilitza per biomolècules que poden donar fluorescència. Hi ha molts animals marins que es veuen al fons del mar perquè emeten fluorescència. La que ho fa es la GFP ( proteïna verda fluorescent). En el seu interior té un tripèptid (Ser-Try-Gly). Aquesta part no es un cromòfor, també un enllaç dóna lloc a aquest fenomen.
Perquè hi ha fluorescència?
Hi ha una reacció que dóna lloc a un enllaç no proteic que té e. Dobles coordinats i són els que tenen fluorescència. Té lloc en múltiples etapes.
Mitjançant enginyeria genètica del gen de GFP és possible obtenir variants d’aquesta proteïna amb diferents espectres de fluorescència. Per exemple, en la proteïna fluorescent groga (YFP). Altres variants de la GFP tenen fluorescència blava (BFP) o lila (CFP),... Totes emeten radiacions en la part visible i la podem veure.
FRET
Què passa si dues molècules interaccionen?
Interatòmica: amb qui interacciona una molècula. Abans estudiàvem les molècules per separat, però tenen interaccions. Però... com sabem si tenen interacció? Amb la fluorescència. Si no tinguéssin fluorescència no veuríem si passa o no.
Generen proteïnes quimeres (proteïna mostra+una altra cosa:proteïna fluorescent com la CFP o YFP).
A CFP
B YFP
La proteïna A i B poden actuar com a dominis (sense canvis).
La energía total emitida en forma de luz es siempre menor a la energía total absorbida y la diferencia entre ambas es disipada en forma de calor.
Si no interaccionen d’una 433nm, emetran una longitud de 476nm (més gran, de menys E).
Si interaccionen, la que rep és capaç d’excitar a la molècula del costat, i és aquesta la que emetrà.
Si dóna blau, no han interaccionat. Si dóna taronja sí han interaccionat.
La relació, doncs, entre l’emissió de llum a 527 i 476 nm és, per tant, una mesura de la interacció de la proteïna vermella i la púrpura.
*La blava transmet l’energia a la yellow perquè ja hem triat una longitud d’ona (476nm) que sigui la que activa el YFP.
Una molècula fluorescent excitada, tal com GFP o YFP, pot utilitzar l’energia del fotó absorbit de dues maneres:
- Per fluorescència, emetent un fotó de longitud d’ona lleugerament superior (menor energia) que la de la llum excitant.
- Per transferència d’energia de ressonància de fluorescència (FRET), en la que l’energia de la molècula excitada (el dador) passa directament a una molècula pròxima (l’acceptor).
Aquest segon (FRET) només és possible quan el dador i l’acceptor estan molt pròxims.
No només serveix per veure si passa o no passa una reacció, sinó també per quantificar.
Passa de la forma activa a la passiva. Ens interessa quants cAMP han calgut en la reacció. Ho fem ajuntant amb molècules fluorescents adequades i quantificant quanta llum deixa d’emetre podem veure quants cAMP s’han utilitzat.
Quan la cAMP augmenta, les subunitats es dissocien, per lo que para el FRET.
Per lo que la emissió a 460nm (dissociada) i 545nm (unides) ofereix una mesura sensible de la concentració de cAMP.
RESUM: amb marcatges de fluorescència podem veure si passa o no passa una cosa i, fins i tot, en quina quantitat.
DICROISMO CIRCULAR:
Tècnica espectroscòpica que proveeix informació de l’estructura de macromolècules biològiques.
POLARITZAR: fer-la vibrar en un pla concret o en uns plans.
separen depenent de la seva massa i càrrega i finalment, són detectades per un dispositiu adequat.
Doncs, un espectròmetre de massa serà una informació bidimensional en funció de la relació m/z.
Hi ha partícules grans, mitjanes, petites,... En relació a m/z (massa/càrrega) corren més o menys. Les més petites aniran més ràpid que les grans.
L’aparell és un cronòmetre que calcula el temps que triga des que surt fins que impacta en el detector. Les més petites arriben abans i les més grans arriben més tard.
Utilitzen el TOF: time of Flight (temps de vol) i es tradueix a massa molecular.
És molt fiable i precís. No pas com una electroforesi o gel filtració.
Podem parlar de MS o MS-MS (quan estan col·locades en tàndem).
- Podem separar un pèptid que passa per un col·lisionador i es trenca el pèptid en trossos petits de cadascun dels aminoàcids i podem seqüenciar la proteïna. S’utilitzen dos aparells MS en tàndem per seqüenciar proteïnes. Consta de un espectròmetre de masses seguit de una cel·la de col·lisions i després el segon espectròmetre de masses. Quan la mostra passa per el MS 1 els components de la mostra se separen i s’ordenen d’acord amb la relació m/z. Posteriorment passen per la cel·la de col·lisions on es generen fragments com a productes de la seva col·lisió i aquests fragments generats passen per el MS 2 els quals es poden correlacionar amb les molècules intactes produïdes en el MS 1.
Gràcies a aquesta tècnica es poden detectar i quantificar selectivament compostos de mostres complexes d’acord amb el seu patró de fragmentació.
Resum: podem aconseguir partir la proteïna i aconseguir el seu PM.
També tenim altres tècniques com ressonància magnètica nuclear i microscòpia electrònica. (s’ho ha passat per sobre).
RECOMANO: http://www.medigraphic.com/pdfs/actpedmex/apm-2009/apm095e.pdf
CRISTALOGRAFIA DE PROTEÏNES I DIFRACCIO RAIG X:
Per poder veure un objecte cal irradiar-lo amb una longitud d’ona més petita de la de l’objecte. Així podem veure-la.
Es comporta com si fós un microscopi, però no ho és. Cal una yuxtaposició de processos per arribar a la composició de la proteïna.
Per utilitzar-lo hem de tenir un cristall de proteïna. Hem de tenir també una font de raig x (una llum monocromàtica, no sigui bruta). Se solen fer quan n’hi ha, amb un sincrotró (accelerador de partícules).
Els raigs X interacciona amb els electrons externs dels orbitals de les molècules.
Obtenim un mapa de difracció que es pot transformar en dades d’on són en l’espai els electrons. Interpretem aquests mapes en estructures en 3D de la proteïna. No es pot afirmar que és un mètode que ens permet veure la proteïna, però ens porta a veure en 3D la proteïna.
Ressonància magnètica nuclear:
És un fenomen del nucli atòmic. Utilitza una propietat nuclear. Alguns nuclis atòmics tenen un spin (rotació, orientació) que poden orientar-se si en el seu entorn (=medi) hi ha un camp magnètic (β).
Crea nivells d’energia.
Quan en una dissolució que conté un sol tipus de macromolècula se li aplica un camp magnètic intens i estàtic, els dipols magnètics s’alineen en el camp en una de dos orientacions: tindrem alguns nuclis orientats com el β (energia petita) i alguns orientats al contrari del β (més energia).
L’espai entre àtoms d’una ret cristal·lina pot determinar-se mesurant la localització i la intensitat de les taques produïdes en una pel·lícula fotogràfica per un feix de raig X de longitud d’ona coneguda després de ser difractat per els electrons dels àtoms.
Recollim una informació massiva entre contactes de protons. Tindrem un mapa de contactes i sabrem les distàncies entre H+^ de la molècula. A partir d’aquí podem interpretar els termes de distància.
L’espectre 2D pot ser interpretat en termes de distància i els d’estructura 3D poden ser construïts per calculacions de distància geomètrica. El resultat és una família d’estructures consistent. Tens una col·lecció de confòrmers, no un únic confòrmer.
