Prepara tus exámenes y mejora tus resultados gracias a la gran cantidad de recursos disponibles en Docsity
Gana puntos ayudando a otros estudiantes o consíguelos activando un Plan Premium
Prepara tus exámenes
Prepara tus exámenes y mejora tus resultados gracias a la gran cantidad de recursos disponibles en Docsity
Prepara tus exámenes con los documentos que comparten otros estudiantes como tú en Docsity
Encuentra los documentos específicos para los exámenes de tu universidad
Estudia con lecciones y exámenes resueltos basados en los programas académicos de las mejores universidades
Responde a preguntas de exámenes reales y pon a prueba tu preparación
Consigue puntos base para descargar
Gana puntos ayudando a otros estudiantes o consíguelos activando un Plan Premium
Comunidad
Pide ayuda a la comunidad y resuelve tus dudas de estudio
Ebooks gratuitos
Descarga nuestras guías gratuitas sobre técnicas de estudio, métodos para controlar la ansiedad y consejos para la tesis preparadas por los tutores de Docsity
Asignatura: Bioquímica, Profesor: Josep Vendrell, Carrera: Biologia, Universidad: UAB
Tipo: Apuntes
1 / 16
Esta página no es visible en la vista previa
¡No te pierdas las partes importantes!
Unitat de Biologia Cel·lular. Departament de Biologia Cel·lular, Fisiologia i Immunologia.
Facultat de Biociències
La malaltia de Hurler és una malaltia lisosomal producte d’una mutació en el gen que codifica per l’enzim lisosomal α-L-iduronidase, responsable de la degradació dels mucopolisacàrids. Els lisosomes de les cèl·lules d’aquests malalts són incapaços de degradar aquests productes. Per contra, els nens afectes de la malaltia de les cèl·lules I tenen una mutació en el gen que codifica per l’enzim N-acetilglucosamina-1- fosfotransferasa (veure figura) que és el responsable de crear el senyal Manosa-6-fosfat (M6P) a tots els enzims lisosomals perquè puguin ser reconeguts pel seu receptor a trans-Golgi i d’aquesta manera es puguin enviar als lisosomes. Els enzims lisosomals sintetitzats per aquestes cèl·lules són perfectament normals però són enviats a l’espai extracel·lular, en comptes de als lisosomes. En principi, la malaltia de les cèl·lules I també podria ser causada per la deficiència en unes altres dues proteïnes: la fosfodiesterasa que elimina la GlnNAc, per exposar la Man-6-P, i el propi receptor de la Man-6- P localitzat a trans-Golgi. Aquests 3 tipus potencials de mutacions (manca de fosfotransferasa, manca de fosfodiesterasa o manca de receptor) es poden distingir per la capacitat que tenen els sobrenedants, d’aquests tres tipus de cèl·lules en cultiu, per corregir els defectes de les cèl·lules de la malaltia de Hurler.
Imagina't que tens línies cel·lulars de 3 pacients hipotètics amb cèl·lules I (el pacient A, el B i el C) que donen els següents resultats: 1.- El sobrenedant de cèl·lules normals corregeix els defectes de B i C, però no els d'A. 2.- El sobrenedant d'A corregeix el defecte de les cèl·lules de pacients amb la síndrome de Hurler, mentre que els sobrenedants de B i C no ho fan. 3.- Si els sobrenedants dels 3 pacients hipotètics es tracten primer amb fosfodiesterasa, aleshores els sobrenedants d'A i C corregeixen el defecte de les cèl·lules de Hurler, mentre que el sobrenedant de B no ho fa.
OS-EL
UDP-GlcNAc UMP GlcNAc
GlcNAc
H 2 O
Fosfotransferasa
Fosfodiesterasa
OS-EL
UDP-GlcNAc UMP GlcNAc
GlcNAc
H 2 O
Fosfotransferasa
Fosfodiesterasa
OS-EL = OligoSacarid-Enzim Lisosomal
A) Quina porció de la molècula de nucleoplasmina és la responsable de la localització en el nucli?
B) Com distingeixen aquests experiments entre transport actiu, en el qual un senyal de localització nuclear provoca el transport a través del complex del porus nuclear, i difusió passiva, en el qual un lloc d’unió per a un component nuclear permet l’acumulació en el nucli?
El gen que codifica la β-globina conté tres dianes de l’enzim de restricció DdeI. Els individus afectes d’anemia falciforme produeixen una hemoglobina anormal anomenada HbS en comptes de l’hemoglobina normal (HbA). La HbS és produïda per la presència d’una mutació en el gen de la β-globina que consisteix en un canvi d’un nucleòtid que destrueix una de les dianes de restricció per l’enzim DdeI (figura).
Tens tres sondes de DNA amb marcatge radioactiu corresponents a les regions A, B i C del gen de la β-globina que s’indiquen a la figura 5.1.
Dibuixa un esquema del patró de bandes que obtindries si fessis un Southern blot de la disgestió amb l’enzim DdeI del gen normal de la β-globina i del gen mutat de la hemoglobina falciform. Raona els dos esquemes.
La proteïna D és un component clau del complex TIM23 (sistema mitocondrial de translocació de proteïnes). La meitat de l'extrem N-terminal de la proteïna D és hidrofílic, mentre que l'extrem C- terminal és hidrofòbic i probablement travessa la membrana 4 vegades, tal i com suggereix el
patró d’hidrofobicitat que es mostra a la figura A. Per esbrinar la disposició de la proteïna D a les membranes mitocondrials, es van realitzar 2 experiments en paral·lel. En el primer es van incubar mitocondris intactes en presència d'una proteasa, mentre que en el segon la incubació amb la proteasa es va realitzar sobre mitoplasts (mitocondris als quals se'ls ha eliminat la membrana externa).
A continuació es va realitzar un western blot (gel de proteïnes transferit a una membrana per detectar amb anticossos específics les proteïnes d'interès) utilitzant 2 anticossos; un específic per l'extrem C-terminal i un altre específic per la meitat N-terminal de la proteïna D. Tant als mitocondris intactes com als mitoplasts es va detectar la proteïna D normal (figura B), però després del tractament amb proteasa es va observar en tots dos casos una digestió parcial de la proteïna D (figura B).
A) La proteïna D és una proteïna integral de la membrana mitocondrial interna o externa? Raona la resposta.
B) En funció de la informació disponible dibuixa un model de la disposició de la proteïna D en la membrana mitocondrial.
Els receptors tirosina quinasa es dimeritzen quan se’ls uneix el seu lligand, fet que provoca l’activació del receptor per fosforilació. Vols estudiar si els monòmers que formen aquest receptor s’autofosforilen o si la fosforilació es dona de forma creuada (un monòmer fosforila l’altre). Per això has construït tres formes del gen del monòmer del receptor tirosina quinasa: la forma normal amb el domini quinasa i tres llocs de fosforilació; una forma més llarga, amb una mutació
Després d’incubar cada una de les preparacions amb el sistema de traducció in vitro , les mostres es van tractar amb una proteasa (proteïnasa K). Passats uns minuts es van precipitar totes les proteïnes, es van desnaturalitzar i es van separar en un gel de poliacrilamida-SDS. La figura 6.1. mostra el patró obtingut després de l’autoradiografia del gel (cada carril està marcat amb el número corresponent a la preparació utilitzada).
A) A partir dels resultats del gel, quin significat tenen les bandes discretes dels carrils 1, 4 i 5? I les bandes difoses de la resta de carrils? B) Què pots concloure dels factors necessaris per a la translocació de proteïnes del reticle endoplasmàtic? C) Quin és el significat de les dues bandes discretes del carril 5?
NOTA: Les proteïnes intactes apareixen com bandes discretes mentre que les proteïnes digerides es mostren com bandes que difonen al llarg d’un carril (smear).
La translocació de les proteïnes de secreció i de les proteïnes de membrana en el lumen del RE està estretament acoblada a la síntesi proteica. Per comprovar que no es pot separar la translocació de la traducció realitzes el següent experiment. Clones un gen en un plasmidi, al costat del promotor de la RNA polimerasa del bacteriòfag que porta aquest plasmidi (Figura 1).
Aquesta construcció et permet transcriure el gen in vitro afegint la RNA polimerasa del fag. A més, per comprovar si la translocació sí es podria separar de la traducció en el cas d’una proteïna molt més curta, has tallat el plasmidi per dos punts de restricció, creant així un mRNA molt més curt de lo normal (Figura 1).
Obtens els dos mRNAs indicats a la Figura 1 i els tradueixes in vitro. En un primer experiment afegeixes microsomes (vesícules derivades de RE) abans de començar la traducció. En un segon experiment afegeixes els microsomes quan s’ha completat la traducció. Per estudiar la translocació tractes algunes mostres amb proteasa o trenques els microsomes i fas un tractament amb endoglicosilasa H (endo H) la qual elimina sucres N-lligats que són afegits en el lumen del RE. Aleshores visualitzes els productes obtinguts en una electroforesi en un gel SDS. (Figura 2).
signal sequence glycosylation promoter sequence
restriction sites mRNA no tallat
mRNA tallat
signal sequence glycosylation promoter sequence
restriction sites
signal sequence glycosylation promoter sequence
restriction sites mRNA no tallatmRNA no tallat
mRNA tallatmRNA tallat Fig 1
Fig 2
En el primer experiment tractes les proteïnes desnaturalitzades amb NEM radioactiu, després trenques els ponts disulfur amb ditiotreitol (DTT) i tornes a tractar les proteïnes amb NEM no radioactiu. En el segon experiment, ho fas al revés, primer tractes les proteïnes desnaturalitzades amb NEM no radioactiu, després trenques els ponts disulfur amb ditiotreitol (DTT) i tornes a tractar les proteïnes amb NEM radioactiu. Separes les proteïnes per electroforesis en un gel de poliacrilamida segons la seva mida (figura).
A) Hi ha alguna de les proteïnes que tinguin ponts disulfur? Raona-ho.
B) Hi ha alguna proteïna extracel·luar que tingui grups sulfhidrils lliures? Raona-ho.
C) Com creus que canviarien els resultats si haguessis utilitzat lisat de cèl·lules que tinguessin compartiments interns envoltats de membrana?
Les activitats de la proteïna tirosina quinasa Wee1 i de la tirosina fosfatasa Cdc25 determinen l’estat de fosforilació de la Tyr15 en la subunitat Cdk1 de la M-Cdk (Cdk mitòtica formada per ciclina B i Cdk1). Quan la Tyr15 està fosforilada, la M-Cdk és inactiva, mentre que quan està defosforilada és activa (figura 8.1.). Les activitats de la Wee1 (Tyr quinasa) i la Cdc25 (Tyr fosfatasa) regulen l’activitat de la M-Cdk.
La regulació de l’activitat de la M-Cdk es pot estudiar en extractes d’oòcits de granota on la Wee és activa i la Cdc25 inactiva, per tant aquesta Wee1 activa haurà fosforilat la Tyr15 i en
Figura 8.1.
conseqüència la M-Cdk serà inactiva. La M-Cdk d’aquests extractes es pot activar ràpidament amb l’addició a l’extracte d’àcid okadaïc, que és un potent inhibidor de les proteïnes Ser/Thr fosfatases. Utilitzant anticossos específics per a cada component, es possible estudiar el seu estat de fosforilació a partir dels canvis de mobilitat en un gel d’electroforesi (figura 8.2.). (Generalment una proteïna fosforilada corre menys en un gel d’electroforesi que la mateixa proteïna defosforilada).
Figura 8.2.
A) A partir dels resultats dels experiments amb àcid okadaïc determina si les formes actives dels enzims Wee1 i Cdc25 són fosforilades o no fosforilades. Completa la figura 8.1. amb aquesta informació i indica si a les transicions hi actua una quinasa o una fosfatasa.
B) Les proteïnes quinases i fosfatases que controlen a la Wee1 i la Cdc25 són proteïnes específiques per residus Ser/Thr o per residus Tyr? Com ho saps?
C) De quina manera l’addició d’àcid ocadaïc provoca un augment de la fosforilació de la Wee1 i la Cdc25 i una disminució de la fosforilació de la Cdk1?
D) Si assumeixes que la Cdc25 i la Wee1 són proteïnes dianes de fosforilació per part de la M- Cdk activa, explica com una petita activitat de M-Cdk pot donar lloc a una ràpida i completa activació de la mateixa.
L’activació del receptor Fas desencadena la via de les caspases, concretament la Caspasa-8, la qual talla la proteïna Bid (a més d’altres) per produir un fragment actiu, tBid, que s’uneix a la membrana mitocondrial. tBid promou la oligomerització de Bax i de Bak, els quals estimulen
Utilitzes fluoresceïna per marcar Fos (Fos-F) i rodamina per marcar Jun (Jun-R) tal i com es mostra a la figura 1.1.-A. La fluoresceïna és excitada per llum de 490 nm i emet fluorescència de 530 nm, mentre que la rodamina és excitada per llum de 530 nm i emet fluorescència de 603 nm. Quan Fos-F i Jun-R estan unides formant l’heterodímer, la longitud d’ona de 490 nm que ha absorbit la fluoresceïna és emesa a 530 nm i transferida a la rodamina la qual emetrà fluorescència de 603 nm. És a dir, la dimerització provoca una disminució de la fluorescència emesa per la fluoresceïna i un increment de la fluorescència emesa per la rodamina com es mostra a la figura 1.1.-B. En presència de DNA la transferència d’energia encara és més eficient (figura B), indicant que la unió del factor de transcripció al DNA implica l’aproximació de les dues molècules fluorescents.
La mesura de la transferència d’energia s’ha utilitzat per mesurar la capacitat d’intercanvi entre els dímers Fos-Jun i els monòmers corresponents en presència i absència de la regió AP-1 (10.1.- C). Incubes les proteïnes Fos-F i Jun-R en absència de AP-1 DNA per permetre la formació d’heterodímers lliures o en presència de AP-1 DNA per permetre la formació d’heterodímers units al DNA. Seguidament afegeixes 10 vegades més de Fos (sense marcatge) a les dues solucions i analitzes l’emissió de fluorescència de 630 nm després d’il·luminar la mostra amb llum UV de 490 nm (figura 10.1.-C).
A) Els heterodímers lliures intercanvien subunitats amb Fos no marcat? Ho fan els units al DNA? Raona la resposta B) Tenint en compte que hi ha diferents proteïnes amb dominis de cremallera de Leucina a les cèl·lules i considerant que els resultats de la figura 10.1.-C són els típics que presenten les proteïnes amb aquests dominis, explica quin comportament s’esperaria observar entre les diferents proteïnes cel·lulars, no només entre Jun i Fos, sinó amb altres proteïnes que presenten aquests dominis.
La translocació de les proteïnes de secreció i de les proteïnes de membrana en el lumen del RE està estretament acoblada a la síntesi proteica. La naturalesa co-traduccional de la translocació en eucariotes ens proporciona un assaig específic i sensible dels primers passos en la biosíntesi d’aquestes proteïnes, però és un obstacle per elucidar el mecanisme de la translocació en sí mateix. Per exemple, en un sistema acoblat com aquest, és difícil determinar si el ribosoma “empeny” la proteïna a través de la membrana o bé si la maquinària de translocació “estira” d’ella cap al lumen del RE. En un intent de separar la traducció de la translocació has clonat un gen en un plàsmid, al costat del promotor de la RNA polimerasa del bacteriòfag que porta aquest plàsmid (figura 12.1.). Aquesta construcció et permet transcriure el gen in vitro afegint la RNA polimerasa del fag. A més, tallant el plàsmid per diferents punts de restricció, es poden crear mRNAs més curts del normal (figura 12.1.).
Obtens els tres mRNAs indicats a la figura 12.1. i els tradueixes in vitro. En un primer experiment afegeixes microsomes (vesícules derivades de RE) abans de començar la traducció. En llevats, s’ha observat que la translocació també pot ser post-traduccional. Sabent això, en un segon experiment afegeixes els microsomes quan s’ha completat la traducció. Per estudiar la translocació tractes algunes mostres amb proteasa o trenques els microsomes i fas un tractament amb endoglicosilasa H (endo H) la qual elimina sucres N-lligats que són afegits en el lumen del RE. Aleshores visualitzes els productes obtinguts en una electroforesi en un gel SDS. (figura 12.2.)
Figura 12.
Acetil CoA carboxilasa : aquest enzim produeix malonyl CoA a partir d’acetil CoA i és l’enzim que limita la velocitat en la síntesi d’àcids grassos. Triglicèrids lipasa : aquest enzim hidrolitza els triglicèrids per produir àcids grassos i diglicèrids; és l’enzim que limita la velocitat en la degradació de triglicerids Fosfoproteïna fosfatasa : aquest enzim defosforila els fosfats de residus de Ser o Thr de moltes proteïnes, es troba en cèl·lules que emmagatzemen glicogen Glucosa permeasa : aquesta proteïna transporta glucosa des del fluid extracel·lular cap a l’interior dels adipòcits.
La figura mostra varies reaccions de la ciclina B i la Cdc2 (Cdk1) basades en unmodel matemàtic de la progressió del cicle cel·lular (línies puntejades) i de l’activitat de la MPF (línies sòlides) en cèl·lules normals i en cèl·lules portadores de diferents tipus de mutacions.
A. Indica a la figura (a) quina forma molecular té la MPF activa i posa els noms dels enzims que catalitzen cada pas indicat per les línies solides.
B. Indica quins gens estan delecionats per donar els fenotips dels 3 mutants. Raona la resposta
