¡Descarga Tema 9 - Caracterització estructural de macromolècules y más Apuntes en PDF de Bioquímica solo en Docsity!
TEMA 9: CARACTERITZACIÓ ESTRUCTURAL DE MACROMOLÈCULES
1. ESPECTROSCOPIA
L’espectroscòpia és l’estudi de les interaccions entre la radiació, generalment electromagnètica (llum), i la matèria com a funció de longitud d’ona (l). La matèria seria la nostra mostra i la interacció de la radiació amb la matèria pot resultar en diferents fenòmens que poden ser observats i seguits de diferents maneres. El terme espectrometria és emprat per a descriure les tècniques espectroscòpiques usades per a avaluar la quantitat d’una espècie química determinada. 1.1. L’espectre electromagnètic i detall de la zona visible L’espectre electromagnètic te diferents regions de les quals nosaltres, només estem familiaritzats amb les visibles, que van de 380 a 750nm, però a part té altres zones que tenen una longitud d’ona més petita (que permeten obtenir majors resolucions) fins a zones amb longituds d’ona més grans que ja no s’estudien. Aleshores podem intentar acotar resolucions més globals o detallades en funció de l’espectre. Els mètodes espectroscòpics son mètodes que consisteixen en incidir un feix de llum contra la matèria (mostra que vull analitzar) i quan xoquen contra aquesta, generen un canvi en la radiació, i així obtenim diferents tipus de fenòmens o informacions, com a longitud d’ona o absorbància. Com més baixa és la longitud d’ona de la mostra, major resolució ens dona en l’estudi que fem del procés. Per exemple, no podem obtenir informació sobre com interacciona un aminoàcid amb un altre, perquè es mouen en longituds d’ona que no estan en l’ordre dels Armstrong, i n’haurem d’agafar mes baixes. Per tant, hi ha d’haver concordança entre l’espectre i el que esperem obtenir.
1.2. Principi bàsic de l’espectroscòpia d’absorció Podem fer servir l’estructura aromàtica dels aminoàcids per mesurar l’absorbància de les molècules, a unes longituds d’ona determinades. Per no totes les molècules absorbeixen, ni totes a les mateixes longituds d’ona. Quan volem fer servir l’absorbància per predir concentracions, hem de saber on té el seu punt màxim (a quina l té el màxim d’absorbància), i per això es va variant la longitud d’ona per anar observant i poder trobar on hi ha el màxim d’absorbància. Un cop s’obté, es treballa amb aquest màxim d’absorció de la molècula que estem seguint, i ens permet un seguiment de la concentració.
2. DETERMINACIÓ DE LA CONCENTRACIÓ DE PROTEÏNES La concentració depèn de la relació entre la llum incident i la tramesa (llum absorbida). Utilitzem la llei de Lambert – Beer, en que hi ha una relació lineal entre la quantitat de llum que absorbeix una mostra i la seva concentració. Com més concentració hi hagi, més absorbància tindrem, fins que arribem a un punt de concentració en que es perd la linealitat de manera que per molt que s’augmenti, no serà proporcional a l’augment de l’absorbància. Les bases nitrogenades dels nucleòtids son anells aromàtics amb molts dobles enllaços que aporten la capacitat d’absorbir en l’ultraviolat, com les proteïnes (màxim a 280nm), però el màxim d’aquests està desplaçat i es troba més aviat en 260. En canvi, les nostres cèl·lules de l’ull veuen longituds d’ona que corresponen a la regió visible de l’espectre. Aquestes característiques d’absorció a diferents longituds d’ona, també es fan servir per analitzar canvis estructurals o la unió de lligands. 3. ESPECTROSCOPIA D’ABSORCIÓ CONTRA FLUORESCÈNCIA En l’espectroscòpia, els àtoms de la molècula quan incidim un feix, pateixen i donen lloc a un procés d’excitació degut a l’absorbància, de manera que els electrons pugen a un estat energètic en el qual extraiem informació com la longitud d’ona. En altres mètodes, després d’arribar a l’estat d’excitació, retornen al seu estat basal, i aquest retorn pot donar-se en forma de calor, radiacions, moviment... Hi ha altres molècules que quan son excitades amb radiació, absorbeixen i pugen al seu estat d’excitació major. Quan han de relaxar-se, alliberen la seva energia emetent llum, fenomen conegut com a fluorescència. Per tant, es tracta d’un cas concret d’espectroscòpia d’absorció. Exemple: polseres dels concerts. En el fons, el que es produeix son reaccions químiques de molècules que quan reaccionen emeten fluorescència, de manera que es tracta d’un procés de quimioluminescència.
Exemple 2: si augmenta la concentració del AMP cíclic, aquesta subunitat interacciona amb R i la senyal la veurem blava (activitat), i deixa de ser verda (inactivitat). Per tant, la intensitat de la senyal de color blau és proporcional a la concentració d’AMP cíclic. Espectroscòpia de dicroisme circular Hi ha una tècnica en que la llum incident és llum polaritzada, que és llum on l’espectre té molts factors. Aleshores, hi ha molècules (proteïnes) que tenen la propietat de desviar la llum incident quan és polaritzada, que s’anomena cromòfors quirals, i aquests son els carbonis quirals o asimètrics de les proteïnes, de manera que les podem aprofitar. La espectroscòpia de CD s’usa per calcular el percentatge de cada tipus d’estructura secundària en una proteïna i per fer un seguiment dels canvis estructurals. Hi ha una sèrie d’aparells que permeten detectar aquesta desviació de la llum polaritzada à els dicroismes circulars. Agafem la barreja de la proteïna, la sotmetem a aquest tipus d’espectroscòpia, i obtenim una informació sobre la seva estructura secundaria en funció de la disposició dels aminoàcids específics dins l’estructura secundària que absorbirà i difractarà d’una manera o altra la llum polaritzada, en funció del tipus d’estructura secundària que sigui. Això ens permet veure canvis, i el contingut i tipus d’estructura secundària de la nostra mostra o molècula (proteïna o cromòfor), que s’analitzaran i reconeixeran seguint uns patrons. Per exemple (en la imatge), el perfil blau és típic d’una estructura en hèlix alfa i el vermell de la fulla beta, de manera que podem saber l’estructura secundaria depenent del patró d’absorció que obtenim.
Espectrometria de masses És un mètode per calcular la massa molecular de les macromolècules i per seqüenciació de proteïnes (“finger Printing”). Permet calcular la massa d’una macromolècula al detall, no com el gel filtració o la electroforesi. En aquest cas, hi ha el MALDI – tof, on el tof detecta quant temps triga la mostra en arribar fins als detectors, i pot fer una relació del que pesa la mostra. És un mètode per analitzar amb molt detall masses i també permet fer seqüenciacions de proteïnes. Si tenim una barreja de proteïnes que no sabem que son, l’agafem i la sotmetem a digestió tríptica (enzimàtica) amb enzims dels quals coneixem la seva especificitat el tall. Després sotmetem la barreja a un maldi – tof i analitzem tots els pèptids que formaven la proteïna inicial. La bateria de pèptids es sotmeten a una base de dades que es dedica a analitzar totes les proteïnes de la base i comença a fer cerques de coincidències amb els pèptids obtinguts. Quan troba una diana coincident amb el patró de pèptids obtingut, podem saber quins pèptids formen la proteïna i de quina es tracta. Per tant, el finger Printing consisteix en un mètode per esbrinar la seqüenciació de proteïnes, per caracteritzar proteïnes desconegudes mitjançant les bases de dades. L’alçada dels pics és informativa de quant pesa, però no és quantitativa, ja que no informa de la quantitat de molècula que hi ha. Només informa cada pic en funció de si és més alt o mes baix, de la capacitat que té la molècula per poder volar. El maldi, per tant, no és una tècnica quantitativa sinó qualitativa. Cristal·lografia de proteïnes i difracció de raig X Última tècnica amb avantatges à pots obtenir l’estructura tant de molècules petites com de grans complexos moleculars, tot i que necessites que l’estructura de la molècula que vols obtenir cristal·litzi, es formi un cristall i que una molècula cristal·litzi o no és pràcticament aleatori. Aleshores pot sortir o no. Perquè en el fons, tenim la molècula i li fem incidir un feix de raigs X que quan impacta amb els electrons de l’àtom de la mostra, una part l’absorbeixen i l’altre la dispersen. El detector capta la dispersió, de manera que necessitem una bona molècula de cristall que impliqui tenir tots els elements en la mateixa disposició per tal que quan incidim el raig de llum, les ones que generen la dispersió s’uneixin, la senyal d’intensitat augmenti, i es pugui detectar. Per tant, podem cristal·lografiar pràcticament tot el que tingui aquesta capacitat i així poder fer aquest efecte de zoom. Aleshores, incidim el làser de raigs X al cistell, que
estan separats per una energia molt petita, amb molta longitud d’ona i molt poca freqüència. Els tres importants son hidrogen, carboni 13 i nitrogen 15. Es creen molècules recombinants. L’RMN ens dona espectres i en l’eix horitzontal es representa la freqüència. Espectroscòpia bidimensional: també existeix en 3,4,6 dimensions. La de dues dimensions l’hem d’interpretar com una diagonal i diferents pics al voltant. Tot és simètric. Si mirem la diagonal amb perspectiva, veuríem un espectre, que corresponen a les corbes de nivell, de manera que veiem una cadena de muntanyes. On hi hagi mes seran pics mes alts. El que ens interessa és el que es troba a fora de la diagonal. 5.2 à el protó 5 i 2 tenen algun tipus d’interacció. De la mateixa manera que passa amb els protons, també passarà amb la resta de la molècula, i per això obtenim els gràfics d’espectrometria bidimensional. Amb aquest experiment deduïm les estructures 3D de les proteïnes. Fent correlacions en què les freqüències de dos protons interaccionen, deduïm proximitats. Sempre que fem els càlculs, hem de fer aproximacions, ja que sol haver inexactitud en les dades.
