¡Descarga Tema 10 - DNA Recombinant y más Apuntes en PDF de Bioquímica solo en Docsity!
TEMA 10: DNA RECOMBINANT
El dogma central de la biologia molecular explica de manera simplificada que el DNA es replica, es transcriu en RNA, i una part d’aquest genera la traducció del missatge en forma de proteïnes. Replicació del DNA El DNA es replica en forma discontinua, una de les cadenes es replica a trossos degut a que sempre és 5’ – 3’. Transcripció del DNA La transcripció té lloc de 5’ – 3’ i de N’ – C’. Els codons s’ordenen en funció de la seqüencia de la taula. L’anticodó és un altre RNA que s’encarrega de reconèixer el RNA i unir un aminoàcid en rRNA. DNA recombinant És un DNA creat de manera artificial que combina seqüències que no es troben juntes a la natura, sinó que es creen en laboratoris o amb l’encreuament d’espècies al llarg del temps. Sobreexpressió de proteïnes: és la producció recombinant de proteïnes que es genera en el laboratori. Està implicat en el DNA recombinant. Trobem, per exemple, la producció d’insulina humana a partir de llevats o bacteris. Clonatge És la creació de copies idèntiques d’un organisme, però també el fem servir per referir- nos a la clonació del DNA o una peça, com un gen. Material i metodologia Objectiu: volem aïllar un gen específic a partir d’un organisme front i el volem clonar i produir un altre tipus de cèl·lula, com per exemple el gen que expressa la insulina. Passos bàsics: o Tallar el DNA d’interès en els límits dels gens, dins dels límits codificants de l’organisme que ens interessa. o Seleccionar un suport de DNA adient, a on inserir el DNA aïllat de l’organisme d’interès i que faci de transport en l’organisme hoste, que s’anomena vector. o Inserir el gen al vector. o Inserir el vector a la cèl·lula hoste. o Identificació dels clons que han incorporat el DNA d’interès. o Fer que la cèl·lula hoste produeixi múltiples copies del DNA recombinant.
Eines bàsiques del clonatge
- Enzims de restricció.
- Vectors de clonatge.
- Biblioteques de DNA.
- Hi ha altres com les DNA polimerasa, lligasa, etc. Endonucleases de restricció Son enzims que hidrolitzen l’enllaç fosfodièster de seqüències d’àcids nucleics. Ho fan en seqüències específiques, i de forma molt fiable i no de forma inesperada en reaccions creuades. Son enzims que es troben en bacteris, ja que tenen una ràpida adaptació al medi. El fet que aquest bacteri generi resistència és perquè tenen enzims que generen DNA nous al seu interior, i son els plasmidis (vectors). Els enzims de restricció poden realitzar dos tipus de talls: § Tall recte: tallen les dues cadenes del DNA exactament pel mateix punt, a la mateixa alçada. Les noves cadenes ja no podran trobar-se a no ser que un enzim concret ho provoqui. Aquest tall dona lloc a extrems rom. § Tall en zig – zag: els enzims tallen una de les cadenes per un punt i la cadena complementària per un punt lleugerament diferent, de manera que les noves cadenes de DNA encaixaran com un puzle i podran trobar-se fàcilment. Aquest tall dona lloc a extrems cohesius. endonucleasa Si tenim un plasmidi (vector) tallat amb uns enzims concrets, podem tornar a col·locar el DNA en un organisme diferent però en la posició que es trobava prèviament gràcies a les DNA – lligases. Això és el que dona lloc al DNA recombinant. Els plasmidis son molècules de DNA circular, i son perifèriques al DNA central. Per tant, és una de les cadenes que es troba apart en el cromosoma. Son eines d’adaptació de
Clonació d’un DNA aliè fent ús del plasmidi pBR Partim d’un plasmidi (pBR322), que és capaç de treballar en molts bacteris i porta lligats l’ampicil·lina (verd) i la tetraciclina (blau), que son dos gens de resistència antibiòtica. Suposem que hem generat fragments de DNA. Els enzims de restricció sempre trenquen la seqüència per punts específics, i en aquest cas han trencat just per la meitat del gen verd (ampicil·lina), de manera que aquest deixa de tenir eficàcia. Ens fem dues preguntes: o Quants bacteris tenen el plasmidi acoblat? o Dels que presenten el plasmidi, quins tenen el correcte? Les cèl·lules E. coli es transformen i després es cultiven en plaques d’agar que contenen tetraciclina per seleccionar a aquelles cèl·lules que contenen un plasmidi. Les colònies individuals es transfereixen a posicions coincidents en plaques addicionals. Una placa conté tetraciclina, i l’altra conté tetraciclina però també ampicil·lina. Les cèl·lules que creixin en tetraciclina però no en la placa que conté tetraciclina i ampicil·lina, seran es que continguin el plasmidi recombinant i no siguin resistents a l’ampicil·lina (DNA aliè). Les cèl·lules que no tinguin el DNA aliè, seran resistents i creixeran en les dues plaques. Identificació d’una seqüència particular de DNA Southern blotting: transferència de DNA d’un suport a un altre. El Southern blotting ens interessa per saber que el genoma té múltiples copies d’un mateix gen, de manera que si coneixem la seqüència d’aquest gen, podem agafar
l’encebador que sigui complementari, i al tros de genoma li podem posar color per seguir- lo. Aleshores, hibridem el DNA genòmic que volem validar amb l’encebador marcat (sonda) i fem un gel. Si només veiem una banda en aquest gel, vol dir que la sonda només ha reconegut un punt, mentre que si veiem diverses bandes, significarà que ha reconegut més d’un punt. És un mètode d’identificació de seqüències de DNA. Te moltes aplicacions com per exemple poder fer una empremta dactilar del DNA per buscar al sospitós d’un crim. S’extreu el DNA de la sang, i s’hidrolitza amb endonucleases de manera no específica. S’obtenen fragments petits que es poden utilitzar en la electroforesi, i el DNA de la víctima i del sospitós tindran un patró de DNA igual, ja que les seqüències hauran trobar un DNA complementari i s’hauran enganxat (trobem sondes). PCR: Reacció en cadena de la polimerasa Suposem que volem amplificar una seqüència de DNA. És molt important i necessari conèixer la seqüència o almenys una part. Passos:
- Escalfem per desnaturalitzar a més de 85ºC, i separem les dues cadenes de DNA.
- Afegim els primers (encebadors). Aquests son complementaris a les seqüències dels extrems.
- Afegim la taq polimerasa (Thermus aquaticus), que és capaç de treballar a aquella temperatura i pot sintetitzar el DNA, cosa que la DNA polimerasa no pot fer.
- Baixem la temperatura per formar la cadena dúplex.
- Es repeteix el procés successivament. Els encebadors seran iguals que a l’inici. En un moment donat tindrem 4 molècules (dues més llargues), i quan es combinin trobarem 8 molècules, de les quals dues seran llargues, dues seran curtes, i les altres dues seran encara més curtes, que seran les seqüències que volíem amplificar. Com més cops realitzem l’experiment, més seqüències que volem amplificar obtindrem. Després de 20 cicles, tindrem al voltant d’un milió de fragments. S’agafa un tros cada cop més petit perquè la polimerasa només va en una sola direcció i la part final que abans s’agafava, ja no té seqüència compatible i per tant, no és utilitzada. La PCR s’usa per tenir un tros de DNA amplificat que es pugui unir a un plasmidi. Això es fa afegint una petita seqüència no complementaria als extrems del fragment que es vol amplificar, i aquestes seqüències que afegim seran complementaries entre si, de manera que al final els fragments que obtindrem seran complementaris. *STR: Short tàndem repeats. Els fragments es fan córrer per una columna i es separen per masses moleculars. Com que hi ha variabilitat, sabem que l’empremta serà diferent en tots els individus.
Exemple 1: GFP S’han fet estudis en que canviant una petita part de la proteïna, obtenim un rang de colors molt gran, i tots son variants de la mateixa proteïna. La GFP és útil com a proteïna de fusió, ja que permet una fàcil localització de la proteïna, ja que ens indica on està el que busquem i només actua quan la proteïna a la qual acompanya està transcrita. Exemple 2: TAP Cal tenir dues columnes. Trobem una proteïna diana (vermella) que es troba unida a un pèptid i a una proteïna A. La proteïna A s’uneix a una columna que té IgG (tenen una unió molt forta). Quan la posem en contacte amb la proteasa d’una cèl·lula, algunes s’uneixen. Tot allò que no s’uneix és rentat, i a continuació trenquem el punt d’unió, i fem que l’afinitat es produeixi entre el pèptid i una altra Ig en una altra columna. Canviant mutacions veiem que la proteïna verda segueix unint-se a la proteïna diana. Seqüenciació del DNA Trobem una tècnica que és molt clàssica i ja ningú la utilitza, que és la següent: Consisteix en muntar 4 reaccions en paral·lel que tenen 4 nucleòtids necessaris i un nucleòtid modificat (ddNTP) en petites quantitats, de manera que incorporar aquella modificació no permet a la polimerasa seguir construint. Després carreguem cada pou amb un gel per separat, de manera que la polimerasa començarà a construir en el pou A fins que trobi una A modificada, que és quan s’aturarà. Sempre s’acabarà aturant, perquè anirà trobant A, T, C i G modificades. En el gel, si la banda més petita és la G, doncs aquest serà el primer nucleòtid, i així anirem llegint la seqüència. Cal tenir en compte que la seqüència que ens interessa no és la que estem llegint, sinó que hem de fer la complementaria, que és on trobarem la mutació. *En qualsevol moment que els ddNTP siguin incorporats, la reacció finalitza. Actualment, la evolució ha permès fer un experiment més fàcil: cada base modificada va associada a un color, de manera que amb les barreges, en comptes de posar-les en un gen, es posen en uns detectors que van dient quin color correspon a cada base.
Aplicacions a la biotecnologia Es tracta de fer servir tota la tecnologia del DNA recombinant per fer plantes resistents a paràsits, herbicides o per modificar organismes introduint en el seu genoma gens d’interès, com el que passa en dos ratolins à un dels ratolins té la hormona del creixement, de manera que serà molt més gros que l’altre. GFP: La proteïna verd fluorescent va ser utilitzada com a gen informador sota el promotor del gen “per”, que codifica una proteïna que controla els ritmes circadiaris. La intensitat de la fluorescència segueix una oscil·lació diària i pot ser reiniciada per la llum. Genòmica i proteòmica El genoma humà va ser molt important en el procés de la biologia, però la genòmica va ser un repte tècnic. Un cop es va obtenir el genoma de l’homosapiens, es va fer molt més difícil la proteòmica, ja que era necessari saber quines proteïnes s’expressaven en uns moments i condicions determinats, i nosaltres tenim molts proteomes. El genoma, en canvi, és més estable, i va ser molt important perquè va implicar la coordinació de molts laboratoris i un avenç informàtic molt gran. Proteomes: conjunt de proteïnes expressat per un genoma ne un moment determinat. Proteòmica: és la disciplina que estudia els proteomes. A diferencia del genoma, els proteomes son específics de cada cèl·lula, teixit i moment cel·lular. Construcció del microxip d’ADN Volem saber la diferència del proteoma que s’expressa entre el capgros i l’ou fecundat. Primer de tot obtenir els seus mRNAs que seran diferents i es fa la transcripció inversa. Tenim pous amb una seqüència sintètica que coneixem i correspon a un gen concret. Partim de seqüències proteiques. Barregem els RNA amb el microxip (cada RNA porta un fluorescent) i quan es trobi la complementaria, s’enganxarà. Tenim com a resultat que en alguns punts no hi ha color (el gen no s’expressa), i punts de colors: o Verd: s’expressa el cas de l’ou fecundat. o Vermell: s’expressa el cas del capgros. o Groc: s’han donat els dos casos i s’expressen els dos gens.
