Cuaderno prácticas microbiología, Ejercicios de Microbiología

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AMPLIACIÓN DE MICROBIOLOGÍA (UMU)

CUADERNO DE PRÁCTICAS DE AMPLIACIÓN DE MI CROBIOLOGÍA

TORRELLA MATEU, FRANCISCO CURSO 13- 14

Práctica 1: recuento de microorganismos heterótrofos viables

Introducción

La práctica consiste en determinar el número de microorganismos heterótrofos viables en dos muestras diferentes de agua (balsa y charca). Se realizará primero una dilución seriada y posteriormente dos siembras: una por extensión en superficie y otra por vertido en placa. Transcurrido el tiempo pertinente de incubación procederemos al contaje de microorganismos heterótrofos viables (unidades formadoras de colonias, UFC).

Material

 Muestra de agua de balsa y charca  4 placas Petri con agar nutritivo (siempre en superficie)  2 placas Petri vacías (vertido en placa).  3 tubos de ensayo con solución de Ringer ¼.  Asa de Drigalski  Agar fundido y al baño María  Agitador Vórtex  Micropipetas de 100 μl y 1000 μl  Mechero Bunsen y encendedor  Alcohol de 96º y papel. Con alcohol se esterilizará el puesto de trabajo y el asa de Driglaski en el proceso de siembra.

Procedimiento

Para comenzar a trabajar en condiciones seguras deberemos limpiar nuestro puesto de trabajo. Para ello impregnaremos un poco de papel higiénico en alcohol de 96º. De este modo nos aseguraremos que la mesa queda limpia. Una vez realizado este paso, comenzaremos con el desarrollo de la práctica.

El profesor asigna a cada grupo una muestra de agua. Agua de balsa, B y agua de charca, Ch. los grupos pares recibirán agua de la charca mientras que los impares la recibirán de la balsa. Mi grupo era el puesto de trabajo número 2.

Técnica de las diluciones seriadas

Para realizar las diluciones utilizaremos la micropipeta de 1000μl

Es importante recordar que debemos cambiar la punta de la micropipeta con cada dilución puesto que estamos pasando de menos dilución a más.

Asa de Drigalski Siembra en superficie

Siembra por vertido en placa

Cogeremos 0,1 ml de la dilución 10-3^ y lo depositamos en el centro de la placa de Petri vacía. Para esta técnica vamos a utilizar el agar fundido, que permanece en el baño María a 42ºC. Vertemos dicho agar en la placa y dejamos que solidifique. A continuación sembramos otra placa, esta vez cogiendo 0,1ml de la dilución de 10-2. Una vez solidificado el agar de ambas placas incubaremos a 37ºC.

Todas las placas deben estar rotuladas con la dilución y el número de grupo

Cada día sacaremos las placas de la estufa para contar las colonias que van apareciendo y volveremos a incubar.

Siembra por vertido en placa

 Composición del agar nutritivo

Ingredientes g /L (H 2 O dest) Triptona (peptona de caseína pancreática) 6, Extracto de levadura deshidratado 3, Agar en polvo o granulado 10 a 20 g (*)

El pH de este medio esta en torno a 7,

Resultados y discusión

En el recuento de cada día en las placas obtenemos los siguientes resultados:

 Siembra por extensión en superficie

Día 10ˉ² (nº colonias)

(nºcolonias) 1^5 239 3

2 7 350 5 6 3 14 388 8 16

Como era de esperar, la placa en la que sembramos la dilución de 10-2^ tiene más microorganismos heterótrofos viables por ml que la de 10-3^ (más diluida). El número de colonias parece ser algo elevado, esto puede deberse a una contaminación, bien por errores en el procedimiento o bien porque la placa es aséptica y no estéril, lo que puede dar lugar a crecimiento no deseado.

En una de estas placas hemos podido identificar una colonia bastante característica. Se trata de Bacillus cereus , un microorganismo Gram positivo productor de colonias butiráceas y pedido en control de alimentos porque provoca desarreglos en el tracto digestivo

Colonias de Bacillus cereus

Conclusiones

Podemos concluir que aunque el vertido en placa es una técnica más sencilla y barata, desde el punto de vista del crecimiento microbiano está mejor considerada la siembra en placa.

Bibliografía

Torrella Mateu, F. Anexo No.1 Medios de cultivo. Prácticas Ampliación de Microbiología 2012. Universidad de Murcia.

Practica 2: calidad microbiológica del agua (“coliformes”)

Introducción

Descubrir la presencia de posibles patógenos en aguas residuales utilizando coliformes como indicadores. Los coliformes forman parte del tracto intestinal de humanos y otros animales y su presencia determinará la contaminación fecal del agua, aunque éstos no sean necesariamente patógenos. Para la práctica se utilizará agua de entrada y de salida de una depuradora.

Como pequeña introducción a los coliformes diremos que son bacilos Gram negativos de la familia Enterobacteriaceae aunque no todos los microorganismos pertenecientes a dicha familia lo son (por ejemplo Salmonella, Shigella, Proteus … no lo son). Son aerobios o aerobios facultativos, oxidasa negativos, que pueden crecer en presencia de sales biliares y fermentadores de lactosa a temperaturas de 35 a 37ºC produciendo ácido y gas en dicha fermentación. Como ejemplos de coliformes tenemos Escherichia, Klebsiella, Citrobacter o Enterobacter.

Material

 Muestra de agua de entrada y salida de una depuradora diluida a 10-  3 tubos de ensayo con solución de Ringer ¼.  9 tubos de ensayo con 9ml de LTB  3 tubos de ensayo con BGB  3 tubos de ensayo con EC  1 placa de Petri con agar MacConkey  Asa de Kolle  Mechero Bunsen  Micropipeta de 1000μl

Procedimiento

Para comenzar, se realizaran las diluciones seriadas de la muestra de agua de salida de la depuradora. Se hacen diluciones de 10-1, 10-2^ y 10-3. Los pasos para realizarlas son iguales que los explicados en la práctica 1, manteniendo las mismas medidas de seguridad y rotulando los tubos.

Colimetría presuntiva

Se lleva a cabo para contar coliformes presuntivos. Para ella utilizaremos el medio LTB, cuya composición se indica más abajo.

 Composición BGB

Medio de cultivo: BGB (Caldo verde brillante sales biliares) Ingredientes g /L (Hdest)^2 O Peptona 10, Lactosa 10, Sales biliares de buey purificadas 20, Verde brillante 0,

El pH del medio es de aproximadamente 7,4.

El medio contiene sales biliares (detergentes) y verde brillante (antiséptico aguantado por enterobacterias), que inhiben el crecimiento de Gram positivas sin perjudicar su metabolismo fermentativo de la lactosa, con la consiguiente producción de ácido y gas (acumulándose en la campana Durham)

Colimetría completa o Test de Eijkman

Consiste en pasar el inóculo de los tubos positivos en la colimetría confirmativa con el asa de Kolle a tubos con medio EC. Esta vez incubaremos a 44,5ºC en el baño María. Esta prueba determina el NMP de coliformes fecales.

 Composición EC

Medio de cultivo: Caldo EC Ingredientes g /L (Hdest)^2 O Triptona 20, Lactosa 5, Sales biliares purificadas y concentradas 1, K 2 HPO 4 4, KH 2 PO 4 1, NaCl 5,

El pH del medio está en torno a 6,

Comprobación tipo de coliforme fecal

Realizamos una siembra en estría para para comprobar el tipo de coliforme fecal del Test de Eijkman. Para ello cogemos una muestra del tubo con EC positivo y sembramos

por estría o agotamiento del asa en una placa con agar MacConkey de la siguiente manera:

 Composición agar MacConkey

Medio de cultivo: Agar MacConkey Ingredientes g /L (H dest)^2 O Peptona 20, Lactosa 10, Sales biliares 5, NaCl 5, Rojo neutro 0, Agar-agar 12,

El pH de este medio está en torno a 7,4. Es un medio selectivo y diferencial para enterobacterias. Contiene sales biliares que inhiben gran cantidad de Gram positivas aerobias o anaerobias facultativas, así como muchas Gram negativas. Este medio diferencia muy bien las bacterias fermentadoras de lactosa (coliformes) como Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae de los no fermentadores como Proteus spp. o Salmonella spp.

-Salida de la depuradora

 Cuando el resultado 3-0-0, el NMP es 23 CP/ml  2,30x10^3 CP/100ml ; con un rango de variación de 4,6x10² a 9,4x10³ CP/100ml.

 Cuando el resultado es 3-1-1, el NMP es 75 CP/ml  7,50x10³ CP/100ml; con un rango d variación de 1,70x10³ a 2,00x10^4 CP/100ml.

Siembra para colimetría confirmativa Los tres tubos sembrados a partir de la colimetría presuntiva dan positivo, por lo que el resultado es el mismo que obteníamos en la colimetría presuntiva (3-0-0)  el NMP es 23 CP/ml  2,30x10^3 CP/100ml ; con un rango de variación de 4,6x10² a 9,4x10³ CP/100ml.

Siembra para colimetría completa Los tres tubos vuelven a ser positivos por lo que los resultados vuelven a ser los mismos.

Siembra para comprobar el tipo de coliforme fecal Podríamos decir que tenemos Escherichia coli, pues además de haber pasado el test de Eijkman ha crecido a 44,5ºC. El medio contiene lactosa y Escherichia coli la fermenta produciendo ácidos, hecho que observamos con el cambio de coloración del medio. Alrededor de las colonias aparece una nube blanquecina, son sales que precipitan a pH ácido. El medio contiene sales biliares. Si queremos asegurarnos completamente de que se trata de Escherichia coli realizaremos la prueba del Indol

Conclusiones

Podemos decir que hemos logrado nuestro objetivo satisfactoriamente, pudiendo aislar coliformes y entre ellos Escherichia coli.

Bibliografia

Torrella Mateu, F. Anexo No.1 Medios de cultivo. Prácticas Ampliación de Microbiología 2012. Universidad de Murcia.

 Composición agar Endo M LES

Medio de cultivo: M Endo agar LES (M= Membrana, LES =Lawrence Experimental Station)

Ingredientes g /L (Hdest)^2 O Extracto de levadura 1, Triptona 3, Peptona P 3, Triptosa 7, Lactosa 9, K 2 HPO 4 3, KH 2 PO 4 1, NaCl 3, Na·desoxicolato 0, Na·lauril sulfato 0, Na 2 SO 3 1, Agar 10,

El pH está en torno a 7,2.

Se adiciona 0,8 g/L de fucsina básica disuelta previamente en agua-alcohol etílico 1:1 al medio ya fundido después de su calentamiento a 90-100ºC.

Debido a que la fucsina básica es incolora cuando está reducida por el sulfito y debe conservarse así hasta el momento de la siembra, las placas de Endo ya preparadas deben ser mantenidas en la oscuridad para evitar la fotooxidación del colorante.

Junto con los tensioactivos que el M Endo LES incorpora al medio, la fucsina básica es también un antimicrobiano que inhibe a las bacterias grampositivas y a muchas gramnegativas excepto las coliformes, entre otras.

Resultados

Observamos cómo han crecido colonias. Algunas tienen un brillo metálico. Éstas son colonias que fermentando la lactosa y produciendo acetaldehído han producido también otros ácidos. El brillo se debe a la polimerización del colorante. Se trata de Escherichia coli, pero para asegurarse deberíamos sembrarla.

La fucsina está reducida.

Na2SO3²ˉ  SO3²ˉ + 2Na+.

NaHSO3²ˉ  HSO3²ˉ (bisulfito, reductor; reduce a fucsina) + Na+

Fucsina básica + HSO3²ˉ  fucsina decolorada (“leucoderivado”).

Pero la fucsina sí tiene color porque los microorganismos producen algo (acetaldehído) que reacciona con el HSO3²ˉ.

β-galactosidasa EMP

Lactosa -------------------------> galactosa + glucosa -------> piruvato ------> acetato --------> acetaldehído

Colonias con brillo metálico ( Escherichia coli )

Conclusión

Con esta práctica que se ha realizado una colimetría de forma rápida obteniendo colonias de E.coli y de otras coliformes a partir del filtrado de una muestra de agua.

Bibliografía

Torrella Mateu, F. Anexo No.1 Medios de cultivo. Prácticas Ampliación de Microbiología 2012. Universidad de Murcia.

Siembra en el medio RV

 Composición medio Rappaport-Vassiliadis

Medio de cultivo: Caldo de enriquecimiento de Rappaport-Vassiliadis (RV) Ingredientes g /L (H dest)^2 O Peptona de soja 5, NaCl 8, KH 2 PO 4 1, MgCl 2 ·6H 2 O 40, Verde de malaquita 0,

La selectividad se basa en los siguientes factores

-El cloruro de magnesio. Este es añadido porque las células necesitan magnesio.

-El pH de este medio está en torno a 5,2. Éste es un pH utilizado para hongos y levaduras pero Salmonella aguanta bien este pH ligeramente ácido por lo que con él haremos el medio más selectivo.

-También se utiliza el verde malaquita, un colorante orgánico cuyo anión es el ácido oxálico y su catión una estructura orgánica. En vez de verse verde se ve azulado debido al pH.

-Otro factor añadido es la temperatura, pues incubaremos a 42ºC, temperatura crítica de Salmonella.

Siembra en placa en medio RVSS

Antes de realizar la siembra, doblamos un poquito el asa de Kolle con el fin de poder coger una gota de la muestra.

Deberemos agitar el tubo con el RV para dispersar los microorganismos en todo el volumen.

Trabajaremos cerca del mechero Bunsen, flameando el asa antes de la siembra.

Metemos el asa de Kolle en el tubo con el medio RV y colocamos la gota en la parte central de la placa que contiene el medio RVSS. Incubamos a 37ºC (deberíamos incubar a 42ºC pero no poseemos una estufa para dicha incubación).

 Composición medio RVSS

Medio de cultivo: Rappaport-Vassiliadis semisólido (RVSS) Ingredientes g /L (Hdest)^2 O Hidrolizados enzimáticos de proteína vegetal y animal 4, Hidrolizado ácido de caseína 4, NaCl 7, KH 2 PO 4 1, MgCl anhidro 10, Verde de malaquita (oxalato) 0, Agar 2,

El pH de este medio está en torno a 5,

Este medio es utilizado para eliminar microorganismos que puedan competir y confundirse con Salmonella

Siembra en estría en medio XDL y SS

Con el asa de Kolle, cogemos una muestra de la placa con RVSS en el borde del halo de migración.

A continuación, procederemos al a siembra por estría o agotamiento de asa. La realizaremos en dos placas con XDL y en otras dos con SS. Siempre alrededor del mechero Bunsen y flameando el asa en cada placa que sembramos.

Después de la siembra, incubamos a la 37ºC