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Asignatura: Microbiología, Profesor: Jerónima Vicente Soler, Carrera: Biología, Universidad: UMU
Tipo: Apuntes
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Lo más característico de la Microbiología es que su objeto de estudio es invisible a simple vista.
Denominamos microorganismo^ a todo ser vivo que a lo largo de su vida no sobrepasan los 1/10 mm de tamaño y que desarrolla un ciclo de vida completo e independiente.
La microbiología consta de 2 grandes bloques evolutivos:
Bacteria Procariotas Arquea Microorganismos
Eucariotas
El avance de la Microbiología dependió de avances en diversos campos, entre ellos la física y el descubrimiento de la microscopía. En el año 1676, Antonie^ van^ Leeuwenhoek^ descubrió^ el^ mundo microbiano gracias a un microscopio simple, inventado por Zacharias Jansen , con lentes que él mismo tallaba; se le considera el padre de la Microbiología. Queda constancia de sus descubrimientos por las cartas que escribió a la Royal Society de Londres , en las que describía los microorganismos que iba descubriendo.
El desarrollo de la Microbiología dependió de todo esto, pero también de otros, como la aclaración de la Teoría de la Generación Espontánea : se pensaba que los microorganismos procedían de la materia orgánica en descomposición. Era una teoría muy arraigada, apoyada por multitud de grandes personalidades como Aristóteles.
Johann Van Helmontz (siglo XVII) apoyaba esta teoría basándose en experimentos que realizó, como el de dejar ropa sucia y trigo en un lugar determinado; al tiempo, la ropa y el trigo desaparecen y aparecen ratones, lo que él atribuyó a un proceso de organización de la materia para crear organismos nuevos. Confundió los efectos con las causas.
En el siglo XVIII, John Needham^ preparó una sopa o extracto de carne y lo calentó, pensando que todos los microorganismos morían con la ebullición, y lo colocaba en un sitio cerrado con un tapón de corcho. Vio que aparecían microorganismos en el extracto y dedujo que procedían de la carne.
Lazzaro Spallanzani hizo el mismo experimento, pero aisló el extracto herméticamente, y no aparecían microorganismos. Dedujo que los microorganismos que había en el experimento de Needham^ pasaban desde el exterior a través del corcho.
Francesco Redi vio que si cogía un trozo de carne, lo hervía y lo dejaba pudrir en contacto con el aire, aparecían gusanos. Sin embargo, si lo tapaba, no. Si se dejaba al aire libre, las moscas dejaban huevos y entonces aparecían gusanos, y tapándolo las moscas no tenían acceso a la carne, por lo que desmintió la generación espontánea.
Esta teoría tuvo una controversia que duró siglos. Los que estaban a favor pensaban que en el aire existía un “fluido vital” que producía la aparición espontánea de organismos.
Lo aclaró Pasteur , que era Químico pero apoyó a los Biólogos, y dedujo que sin microorganismos no había cambio, y que además debía ser un determinado tipo. Además hizo otra contribución, descubriendo la existencia de microorganismos anaerobios.
Dedujo el por qué de todo esto: fisiológicamente, los microorganismos sacan energía de éstos procesos. Secundariamente, el hombre puede sacar provecho de los productos finales.
Otra cuestión que se puso en marcha, una vez descubierto el papel de estos microorganismos sobre la materia orgánica, fue si también podían estar implicados en las enfermedades infecciosas y fuesen causa de transmisión.
En el siglo XVI, Girolano^ Fracastoro^ de^ Verona^ decía^ que^ veía gérmenes en el aire que pasaban de una persona a otra y que ésta era la causa de contagio de enfermedades pero nadie le hizo mucho caso porque la mayoría pensaba que las causas se debían a otros factores, como fuerzas sobrenaturales o desequilibrios de los fluidos corporales.
Los médicos de aquella época comenzaron a introducir técnicas sanitarias incluso sin saber que los microorganismos eran la causa de las enfermedades infecciosas.
En el siglo XIX, Oliver Wendell Holmes^ vio que muchas de las mujeres que daban a luz morían posteriormente. Comprobó que tomando medidas de higiene durante el parto, descendía el riesgo de mortandad y lo atribuyó a una contaminación aérea que provocaba contagio. Ignaz Phillip Semmelweis comprobó que introduciendo técnicas sanitarias durante operaciones quirúrgicas disminuía la probabilidad de contagio.
Robert Lister desarrolló un método de cirugía aséptica: los instrumentos se esterilizaban con calor y se trataban los vendajes con fenol, que destruía las bacterias y evitaba las infecciones de las heridas. Hoy en día el fenol está en desuso ya que la mayor parte de bacterias es resistente a él.
Robert Koch fue el primero en demostrar la relación entre Bacillus anthracis y carbunco. En 1876 enunció los conocidos como^ Postulados de Koch :
Casimir Joseph Davaine vio que en todas las lesiones de carbunco de animales y humanos había Bacillus anthracis , pero no sabía si era un efecto o una causa.
Estos postulados fueron comprobados por Pasteur****. Koch fundó la “ Escuela de Microbiología ” de Berlín, y Pasteur^ fundó el “ Instituto Pasteur ” en París, y la Microbiología empezó a ser una ciencia. Hay aún algunos casos en que la causa es un microorganismo pero no cumple los postulados, por ejemplo, los virus, que no se pueden aislar. Nacen así los Postulados de Rivers , que son los mismos que los de Koch , pero modificados para los virus. Hay bacterias que no cumplen los postulados de Koch, por ejemplo, Treponema pallidum , causante de la sífilis, que no puede aislarse porque no crece en medios biológicos artificiales; o Mycobacterium leprae , que provoca la lepra. Aunque no los cumplen, se sabe que son los causantes.
Existía la idea equivocada de que los microorganismos podían cambiar de forma, ya que cuando una muestra se observaba durante varios días, aparecían distintas formas que los investigadores relacionaban con cambios de forma del mismo microorganismo, y así nació la Teoría del Pleomorfismo. Lo que en realidad sucedía es que unos microorganismos morían y aparecían otros nuevos que se aprovechaban de los productos de desecho de los anteriores, y así sucesivamente, se daba un proceso de sucesión microbiana.
Carl von Linneo , en su Systema Naturae , clasificó a todos los microorganismos en un mismo grupo, llamado Chaos , ya que pensaba que, a causa del pleomorfismo no se podían clasificar. Más tarde se aclaró todo y se descubrió que no cambian de forma ya que presentan un genotipo que determina su forma.
Definimos cultivo^ puro^ como^ aquel^ que^ contiene^ una^ sola^ clase^ de microorganismos, que teóricamente derivan sólo de uno, y por lo tanto son totalmente idénticos. Se ingeniaron muchos métodos para conseguirlo y separar unos microorganismos de otros, sobre todo en la Escuela de Berlín de Koch****. Un discípulo de Koch ,^ Schroeder , dejó media patata en el laboratorio, y al día siguiente vio que aparecían manchas y vio que eran conjuntos de microorganismos, y que en cada mancha aparecía sólo un tipo de microorganismo. Las manchas eran macropoblaciones sí visibles a simple vista y manipulables.
Todo esto permitió rebatir la Teoría del Pleomorfismo , y contribuyó a desarrollar técnicas de cultivos puros, y también aparecen las placas de Petri.
A finales del siglo XIX los investigadores se preguntaron si, a parte de la orgánica, los microorganismos eran capaces de transformar la materia inorgánica.
Muchos de estos descubrimientos iniciales se estudiaron porque las enfermedades que producían tenían impacto económico o en el hombre. Los microorganismos llamaron la atención por la capacidad destructiva o dañina que tenían.
Había, por tanto, que buscar remedios. Esto dio origen a 2 líneas de investigación: la inmunización y la quimioterapia.
- INMUNIZACIÓN -
Se basa en la profilaxis o tratamiento preventivo. El inicio de estas prácticas es antiguo: se iniciaron con las observaciones de Edward Jenner****. Observó que la viruela era una enfermedad tanto humana como vacuna. Se dio cuenta de que las personas que ordeñaban a las vacas afectadas de viruela no adquirían la viruela humana: de algún modo se hacían resistentes. Así sacó muestras de las heridas de la viruela vacuna y las inoculó en humanos sanos. Nacía de esta manera la primera vacuna, denominada así por Pasteur^ que lo hizo en honor a Jenner y sus estudios con las vacas. Actuaba contra enfermedades no sólo de origen viral, sino también de origen bacteriano, como el carbunco.
La vacuna contra la rabia fue elaborada por Pasteur. La rabia es un virus que ataca al sistema nervioso, primero actuando sobre los músculos de la zona de la garganta. Se le llamaba “hidrofobia” porque los afectados, aunque tienen sed, no pueden beber agua porque no controlan la epiglotis. Una mujer llevó a su hijo, Joseph Leister, ante Pasteur^ cuando un perro con rabia le mordió. Pasteur^ le dijo que aún no había probado su vacuna contra la rabia, pero la madre accedió a que vacunase a su hijo y le salvó la vida. El chico quedó tan agradecido que trabajó para Pasteur^ el resto de su vida. Pasteur tuvo suerte: la rabia es la única enfermedad en la que se puede vacunar al paciente después de haberse infectado, porque el virus tarda mucho en llegar al sistema nervioso.
- QUIMIOTERAPIA -
Sólo se aplica cuando ya se ha enfermado. Junto con la inmunización aumentó la esperanza de vida del hombre al doble.
Partió de Paul Ehrlich , que, sugestionado por las ideas de Pasteur sobre la inmunización, pensó que podían existir sustancias químicas con toxicidad selectiva, capaces de dañar a las bacterias pero no a las células. Las llamaba “balas mágicas”.
Ehrlich y Sahachiro Hata empezaron a probar sustancias dañinas para las bacterias de Treponema^ pallidum ,^ que^ provoca^ la^ sífilis,^ pero^ que^ eran inofensivas para las células del cuerpo humano. Después de 605 ensayos encontraron
la sustancia correcta, a la que llamaron “ Salvarsan 606” , y que contenía pequeñas trazas de arsénico. Se disparó toda una línea de investigación.
Pocos años después, Donald D. Woods descubrió las sulfamidas. Alexander Fleming , en 1926, estudiaba el Staphylococcus aureus cuando se dio cuenta de que su placa se había contaminado al caer una espora de Penicillium notatum , un hongo que secretaba alguna sustancia que impedía el crecimiento del estafilococo en sus alrededores. Fue en los años 40 cuando Ernst Chain y^ Howard Florey^ produjeron, por primera vez, la^ penicilina. Poco después, Selman Waksman descubrió la estreptomicina.
Para que una sustancia sea considerada como un antibiótico , debe estar producido por un microorganismo. Las sulfamidas, por ejemplo, no son un antibiótico, sino simplemente un agente químico. Todos los microorganismos que forman antibióticos son esporulados. El hecho de que produzcan estas sustancias no les supone ninguna ventaja ecológica, ya que lo hacen de forma secundaria.
Así comenzó la Era De Los Antibióticos.^ Los microorganismos son muy eficaces y eficientes, y por ello se hacen resistentes por el principio de Selección Natural. Es^ una^ selección^ mediada^ por^ los^ antibióticos.^ Siempre^ aparece^ algún microorganismo resistente por mutaciones.
· Años 50: el 99,99% de Staphylococcus era sensible a la penicilina. · Hoy en día: el 100% de este microorganismo es resistente a la penicilina.
· MICROBIOLOGÍA ACTUAL
La Microbiología Actual estudia a los microorganismos y sus actividades, tanto patógenos como no patógenos. Comprende conocimientos de distintos campos: Ecología, Genética, Bioquímica, Morfología,…
A su vez, la Microbiología se puede dividir en otros campos:
Existe una aplicación clínica para el control de bacterias y virus con impacto en humanos y animales. También hay una aplicación industrial, que saca provecho de las actividades de los microorganismos.
Los Protistas formaron el tercer grupo dentro de la clasificación del Mundo Vivo. Tenían la característica común de tener una organización celular simple, es decir, no forman tejidos.
Robert H. Whittaker propuso una clasificación consistente en 5 reinos. Carl Woese realizó una clasificación de 3 reinos, que es la más usada.
Cuando se introdujeron técnicas moleculares, se realizaron análisis ribosomales, y se vio que había otra clasificación diferente posible, consistente en los siguientes dominios:
**- Eukarya Bacteria
Gracias a los análisis de la unidad 16S ribosomal, en los años 50, por microscopía electrónica, se vio que había 2 claros modelos en la arquitectura interna de las células:
Las diferencias estructurales se corresponden con las funcionales. La discontinuidad biológica más importante dio lugar a 2 filum con evolución paralela pero independiente: Eucariotas^ y^ Procariotas. Pero dentro de los procariotas también había 2 discontinuidades: Bacteria y Archaea. Se cree que primero aparecieron los Archaea: organismos anaerobios que han llegado hasta nuestros días y se encuentran sólo en ambientes extremos que recuerdan a la Tierra primitiva. Son los que comenzaron la evolución hacia los eucariotas.
DIFERENCIAS ENTRE PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS
1) Organización del aparato genético:
2) Estructura citoplasmática:
3) Atributos funcionales:
Eucariotas Procariotas β -lactámicos -^ +
TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS
Todos los sistemas biológicos tienen en común que necesitan unos requerimientos nutricionales: se desarrollan sobre sustancias químicas que les permiten conseguir energía (mediante oxidaciones biológicas) y suministra sustancias para la biosíntesis (reducciones que generan ATP y poder reductor).
Requieren la presencia de:
Los organismos quimiotrofos pueden obtener energía por oxidaciones de compuestos orgánicos (organismos quimioorganotrofos )^ o^ de^ compuestos inorgánicos (organismos quimiolitotrofos). Por ejemplo, los organismos quimiolitoautotrofos son organismos que no necesitan compuestos orgánicos.
Suministran otros elementos necesarios para microorganismos, y algunas los necesitan como requerimiento estructural.
Los microorganismos que necesitan vitaminas suelen necesitar vitaminas del tipo B, sobre todo vitaminas B6 y B12. Requieren su presencia ya formada en el medio.
Nosotros somos organismos quimioorganoheterótrofos.
Cuando los microorganismos tienen los 6 requerimientos en el medio, se dedican a crecer, y lo hacen hasta que se acaba uno de ellos, al que llamamos “factor limitante” , y entonces deja de crecer. Si se le administra este factor limitante en pequeñas dosis, el microorganismo crecerá de manera proporcional a la cantidad administrada. El factor limitante, por tanto, determina el crecimiento poblacional microbiano.
Lactobacillus se utiliza en valoraciones alimenticias de vitaminas. Necesita vitamina B6. Con una gráfica patrón, podemos determinar la concentración de vitaminas en un alimento en función del crecimiento de la problación. Analíticamente, esta técnica es tan exacta como cualquier máquina y no requiere tratamientos o aislamientos de vitaminas, porque aunque vaya mezclada esta vitamina con otras sustancias esenciales, al existir estas ya en el medio en exceso, el crecimiento se rige sólo por el factor limitante.
- CULTIVO Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS -
Los medios de cultivo son el sustrato en el que se desarrollan los microorganismos en el laboratorio.
Se clasifican por:
- Composición química:
**- En placa medios sólidos
Independientemente de la composición química, física o de la disposición, los medios se dividen en función de su finalidad, pudiendo ser:
Por ejemplo, utilizando un medio base con un indicador de PH, podemos determinar si un microorganismo modifica el PH del medio, y nos indica que es un microorganismo que produce ácidos como consecuencia de su metabolismo, es decir, es un microorganismo fermentativo. Si el PH no varía, es un microorganismo que realiza respiración.
Se puede crear un medio mezcla de 2 o de los 3, y son los más utilizados. Por ejemplo, el medio^ McConkey^ (medio^ base^ +^ ácidos^ biliares), que^ inhibe^ el crecimiento de las bacterias Gram+ y facilita el crecimiento de las Gram-, es un medio selectivo, pero si además le incorporamos un indicador de PH, será también un medio diferencial. El medio McConkey tiene lactosa y ácidos biliares. Todos los microorganismos que crezcan en este medio serán microorganismos capaces de romper la lactosa en sus dos subunidades (galactosa y lactosa), es decir, presentan β- galactosidasa. La glucosa es su fuente de energía. Es un medio que aísla muy bien a las enterobacterias.
Por lo tanto:
Organismos resistentes a ác. biliares
metabolismo respiratorio indicador McConkey o fermentativo de PH
Organismos con β -galactosidasa
En muchos casos, se pueden preparar los ingredientes por separado, se esterilizan y se añaden poco a poco o se venden ya fabricados y deshidratados; al añadirse agua ya tenemos el medio de cultivo. Hay ya medios especialmente diseñados para un crecimiento de una bacteria determinada.
Cultivos bacterianos:^ el 99,9% de las bacterias crecen en ellos. Otros, sin embargo, no lo hacen porque necesitan medios vivos: Treponema pallidum ,^ etc… Los^ virus^ tampoco^ crecen^ en^ estos^ cultivos,^ ya^ que^ son parásitos celulares que necesitan células vivas.
Cultivos celulares: constan de una base de células vivas de animales o vegetales y se utilizan para el cultivo de virus. También pueden ser bacterias para estudiar virus bacteriófagos.
a) Asa de siembra: asa con una prolongación metálica que termina en un círculo. Puede convertirse en un asa de picadura. Es buena porque por la tensión superficial nos permite coger gotas. b) Asa de Digraski o Drigalski:^ es importante para la siembra de medios líquidos. Consta de una varilla de vidrio con una especie de triángulo al final y permite extender el contenido de una gota por toda la placa. c) Pipeta Pasteur:^ útil para muestras líquidas. d) Matraz e) Tubos de ensayo f) …
Los cultivos se llevan a cabo cerca de un mechero^ o^ llama : esteriliza el aire de alrededor de la llama y nos permite esterilizar el material.
- TIPOS DE SIEMBRA -
- Muestra líquida: con el asa de siembra se recoge la muestra en forma de gota y se siembra por extensión. - Muestra sólida:^ con el asa de siembra se realiza una siembra por estría; se recorre toda la placa formando estrías, primero más juntas y cada vez más separadas. - Muestra semisólida:^ con el asa de siembra.
Se llevan a cabo una vez que los microorganismos están ya aislados.
Da lugar a colecciones de microorganismos patrón o microorganismos tipo ,^ que^ se^ mantienen^ vivos. Hay^ que^ mantenerlos^ aislados, conservados y así ir coleccionándolos.
CECT: Colección Española de Cultivos Tipo ATCC: American Type Cultives Colection
Para mantenerlos vivos, podemos utilizar diversos mecanismos: a) Resiembras periódicas:^ por ejemplo, en^ tubos de agar inclinados. La resiembra consiste en coger un poco de una población e inocularlo en otro tubo.
b) Adicionar^ a^ los^ medios^ aceite^ mineral^ o^ parafina^ esterilizada : ayudan a retrasar la deshidratación.
c) Conservación a bajas temperaturas: por ejemplo, en nitrógeno líquido (-196ºC); el inconveniente es que el agua intracelular se convierte en hielo que pueden causar cortes y dañar a la célula. Por ello se añade glicerol , DMSO (dimetilsulfóxido). Así se evita la formación de microcristales que pueden dañar la estructura celular.
d) Liofilización:^ implica desecar rápidamente por^ sublimación^ las células que se mantienen congeladas en un medio de alto vacío. Así, le quitamos el agua a los microorganismos sin aplicar calor, y entran en un estado críptico latente. La presión atmosférica actúa como una especie de émbolo que empuja a las moléculas de agua, impidiendo su movimiento debido a la energía cinética de las moléculas. Los microorganismos recuperan su actividad biológica al añadir agua. Están en un estado llamado gliófilo : en este estado, los microorganismos se pueden conservar durante años, incluso décadas.
Fue el desarrollo de la microscopía lo que permitió conocer un poco más sobre los organismos.
FUNDAMENTOS DE LA MICROSCOPÍA
El ojo humano actúa como un instrumento óptico. Mediante la acomodación del ojo, nos da una idea del tamaño del objeto y la distancia que tiene. Existe una limitación: a partir de unos 25 cm de distancia, el ojo deja de acomodarse por mucho que se acerque el objeto. El ojo deja de ver un objeto de 0,1 mm a 25 cm de distancia; el ángulo de entrada sería de 1º, que sería el ángulo mínimo con el que tiene que entrar un objeto para que se forme la imagen en la retina. Este ángulo se va perdiendo también cuando se aleja mucho el objeto.
α
Por eso, definimos a los microorganismos como entidades vivas con un tamaño inferior a 0,1 mm durante su ciclo de vida.
Los microscopios operan aumentándonos el ángulo de entrada de los objetos a estudiar. Éste es el principio básico de todo microscopio.
- CONCEPTOS DEL MICROSCOPIO - 1. Magnificación o aumento: aumento del ángulo de entrada (α). Se obtiene mediante procedimientos ópticos. 2. Contraste:^ sólo podremos ver objetos cuando nos encontramos el objeto en un medio diferente. Se logra mediante procedimientos ópticos dependiendo del microscopio, o mediante tinciones para resaltar el objeto del medio. 3. Claridad o nitidez:^ viene definida por la longitud de onda de la luz que se utiliza y también por cuestiones ópticas.
λ λ PR = PR = 2 ΔΝ 2 η senC
ΔΝ = apertura numérica. Es igual al índice de refracción entre la lente objetivo y el objeto a estudiar por el ángulo que forma el foco de luz con los rayos más divergentes.
ΔΝ = η senC
C
